硫化氢对小鼠SVZ区神经干细胞增殖分化的作用及机制研究.pdfVIP

2 硫化氢对小鼠SVZ 区神经干细胞增殖分化的作用及其机制的研究 中文摘要 硫化氢对小鼠SVZ 区神经干细胞增殖分化 的作用及其机制的研究 中文摘要 硫化氢是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种气体信号分子。研究表明，硫化氢 具有重要的生物学功能，参与体内多个病理生理过程的调节。在中枢神经系统，硫化 氢发挥神经调质样作用，能够调节NMDA 受体介导的神经传导，易化长时程增强效 应形成。但是，硫化氢是否影响神经再生，这方面的研究报道较少。因此，本研究主 要探讨硫化氢是否影响小鼠 SVZ 区神经干细胞的增殖与分化及其信号机制，为揭示 硫化氢的神经生物学功能提供实验依据。 目的：研究硫化氢对小鼠 SVZ 区神经干细胞增殖及分化的影响，并探讨相关的 分子机制。 方法：(1)分离C57BL 小鼠胚胎（E13-14）SVZ 区神经干细胞进行体外培养，悬 浮培养的神经球传代贴壁培养2 次后用于实验；干细胞表面标记物nestin 及Sox2 免 疫荧光共染鉴定神经干细胞。(2)免疫荧光结合western blot 及反转录PCR 的方法鉴定 胚胎神经干细胞内硫化氢内源性合成酶胱硫醚-β-合成酶（cystathionine β-synthase, CBS ）和胱硫醚-γ-裂解酶（cystathionine γ-lyase, CSE ）的表达，Q-PCR 测定CBS 与 CSE mRNA 的相对含量；免疫荧光方法鉴定成年C57BL 小鼠SVZ 区及胎鼠E14 脑 组织切片中CBS、CSE 及nestin 的表达；(3)神经球计数法检测硫化氢供体(NaHS 及 缓释剂GYY4137)作用后神经干细胞的自我更新；Brdu 免疫荧光染色法检测神经干细 胞的增殖；免疫荧光方法标记神经元标记物Tuj-1 与星形胶质细胞标记物GFAP，检 测硫化氢供体作用后神经干细胞的分化；MTT 方法检测神经干细胞的存活率； Caspase-3 免疫荧光染色检测神经干细胞凋亡；反转录PCR 检测胶质源性神经营养因 子mRNA 水平的影响；采用western blot 测定CREB 的磷酸化水平。 结果：(1)免疫荧光方法标记约99%的体外培养细胞表达干细胞表面标记物nestin 及 Sox2，说明成功分离培养纯度较高的胚胎神经干细胞，可以用于本研究。(2)免疫 荧光法检测显示，在成年C57BL 小鼠SVZ 区、胎鼠E14 脑组织切片及体外培养的神 I 中文摘要 硫化氢对小鼠SVZ 区神经干细胞增殖分化的作用及其机制的研究 经干细胞内 CBS 均有较高含量的表达，RT-PCR 及western blot 进一步验证了 CBS 的表达；免疫荧光方法、PCR 及western blot 检测到胎鼠E14 脑组织切片及体外培养 的神经干细胞内CSE 的表达，但在成年的C57BL 小鼠SVZ 区未检测到CSE 的阳性 表达；Q-PCR 法提示体外培养的神经干细胞内CBS mRNA 水平约是CSE 的3 倍。(3) 神经球计数法及Brdu 免疫荧光染色显示硫化氢供体可促进体外培养的神经干细胞的 增殖。在体实验也表明硫化氢供体 NaHS 在一定剂量范围内，呈剂量依赖性地促进 SVZ 区神经干细胞增殖。体外分化实验显示硫化氢可促进神经干细胞向神经元的分 化。MTT 法显示，硫化氢供体NaHS 对细胞活力没有影响。Caspase-3 免疫荧光染色 表明，外源性硫化氢不影响神经干细胞凋亡。此外，NaHS 呈浓度依赖性的升高星形 胶质细胞中胶质源性神经营养因子mRNA 的表达。Western blot 显示NaHS 不改变神 经干细胞内CREB 的磷酸化水平。 结论：外源性硫化氢可促进胚胎和成年小鼠 SVZ 区神经干细胞的增殖，同时促 进神经干细胞向神经元分化，而不影响细胞凋亡；硫化氢促进神经干细胞增殖可能与 其升高胶质源性神经营养因子