苏云金芽孢杆菌工程菌芽孢形态发生的特征.pdfVIP

维普资讯 第22卷 第4期 电 子 显 微 学 报 Vo1．22．N0．4 2003年8月 JournalofChineseElectronMicroscopySociety 2003—8 文章编号：1000—6281(2003)04—027l一05 苏云金芽孢杆菌工程菌芽孢形态发生的特征 郭延奎 ，邵宗泽 ，喻子牛 (1山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018；2国家海洋局第三海洋研究所，福建 厦门361005 3华中农业大学生命科学与技术学院，湖北 武汉430070) 摘 要：苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的表达及晶体的形成与芽孢的发育有关。本文利用电子显微镜观察 了苏云金 芽孢杆菌工程菌不同发育时期芽孢的形态结构特点。结果表明，整个芽孢的发育过程依次经历了前芽孢、双层膜 芽孢、初生芽抱壁形成、芽孢衣与孢外壁形成以及皮层形成等过程 。这与一般芽孢的发育过程不 同，即芽孢衣与孢 外壁的形成时期早于皮层；另外发现孢外壁包被有膜结构，这表明杀虫晶体蛋白的超量表达可能会影响到芽孢的 发育。 关键词：苏云金芽孢杆菌；芽孢发育；芽孢衣；孢外壁 中图分类号：Q932；Q336 文献标识码 ：A 苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis，Bt)，革 1 材料与方法 兰氏阳性、杆状 、内生芽孢 ，是一种重要 的杀虫细 菌…。它的主要杀虫成分是伴孢 晶体 (parasporal 1．1 供试菌株 crystals)，伴孢晶体杀虫蛋白的表达及晶体化通常依 本实验 所 用 菌 株 为 苏 云 金 芽孢 工 程 菌 pBMB1Ac304／BMB171l5J 赖于芽孢 的分化与形成 。晶体与芽孢的形成是一 。 该菌株表达的杀虫晶体蛋 个很复杂的过程，涉及到表达的时空调控、多种大分 白为 133kDa的 CrylAc原毒素，供体质粒是含有 子物质的合成、运输与组装等口。传统的芽孢发育 crylAC10基因的Bt／E．coli穿梭质粒 ，受体菌Bt天然 的基本过程依次是前芽孢形成，双层膜芽孢形成，皮 菌株是经质粒消除后 的无质粒、无 晶体突变株 层形成，芽孢衣(芽孢鞘)合成以及芽孢进一步成熟 BMB171(。 等n J。从形态发生来看 ，晶体一般伴随着芽孢 的 1．2 细菌培养与光镜观察 形成而形成；在转录调控水平上，多数杀虫晶体蛋白 BMB1Ac304／BMB171培养于含 25~／g／rnl红霉素、 (ICPs)的表达、晶体的形成也与芽孢分化 同步；且化 0．5％蛋 白胨 、0．3％牛 肉膏、0．5％葡萄糖 、0．05％ 学组成上两者也有相关性，即ICPs参与了芽孢衣的 MgSO、0．05％KHPO 的液体培养基 中，28oC、200r／ 形成 ，芽孢衣与 ICPs具有 同源性 。另外，在工程 min。分别于 12、15、18、21、24、36h取样。离心后迅 菌的构建中有时发现晶体蛋白的大量表达伴随着芽 速将菌体固定于3％戊 二醛 中，用作电镜样品的制 孢形态结构异常 ，且发酵后期晶体释放困难 。可 备。培养液中菌体的形态直接用相差显微镜或经石 见，Bt芽孢 的分化过程与晶体形成有很大关系，了 炭酸一复红染色后普通光镜观察。 解 Bt工程菌芽孢的形态发育过程对构建高效工程 1．3 透射电镜样品制备与观察 菌很有必要 。 用戊二醛初 固定的样 品再用 1％锇酸二次固 在以前的研究中发现，当有帮助蛋 白P20存在 定，然后乙醇梯度脱水、Epon812树脂浸透、