小麦germin基因克隆及植物表达载体构建.pdf

中文摘要 近年来由于基因克隆技术和遗传转化技术的进步，使得通过基因工程方法改 善作物的抗病性成为了可能。谷类作物真菌病原菌常导致严重减产而给农民带来 巨大的经济损失。一般来说抗真菌转基因的目标是加固植物细胞壁和产生抗真菌 蛋白以直接或|11【J接抑制真菌生长。有些植物病原菌真菌能分泌人量草酸，而草酸 能导致组纵腐烂，足致病过程·r卜J的关键因子。小麦中的germin是含有Mn离子的 同源六聚体，具有草酸氧化酶活性，可将草酸氧化生成H。O。，在发育和防御过程 中起了重要作用。因此将草酸氧化酶基因导入易感病的作物中就是针对真菌分泌 的草酸的抗病基因工程最新认识。本研究的目的是获得小麦germin基因并构建 植物表达载体，为转germin基因研究提供基础。主要结果如下：． ‘ 1．小麦germin基因的克隆与序列分析 gf一2．8 小麦germin具有较强的草酸氧化酶活性。根据GenBank中的germin 上进行同源性比较，结果与germingf一2．8的碱基序列同源性为90％。氨基酸序 列的同源性为96％，其中有九个氨基酸不同，但基本上为同等氨基酸，并且符合 g㈨Ilin中三组氨酸和一谷氨酸的草酸氧化酶活性位点的同源模型特征。 2．Germin基因植物表达载体的构建 将中间载体上的germin基因片段用砌Ⅳ，酶切下来，插入用同样酶切的 12 双元表达载体pBIl上，以菌落PcR筛选重组子。对这些重组予用胁d埘酶切 以进行正反方向检测，所有重组子酶切都得到～大片段和一小片段。但反向克 隆的重组子得到的小片段大小为1，567bp，正向克隆的重组子所得的小片段大小 杆菌1．BA4404，并进行了菌落PeR验证。 3．Gus基因的瞬时表达 进行诱导激活，然后与westar油菜外植体浸染半小时。在28℃暗处共培养两天 后，列材料进行x—Gluc染色，在显微镜下观察，共培过的材料出现有蓝色斑点， 说明Gus基因在油菜材料中能有效表达。 瞬间表达 关键词： germin表达载体 Abstract 111e ofthenew a11d deVelopment gene traIlsfb玎nation cloninggenetic has of for tecllIliquesrecenuy opened the、vayengineering improving缸lgal resistallce of of causeextensive crops．FungaI economic pathogenscr叩plaIlts lofarmers t11e nle fof d枷age byrcducjJlg yield．Genef甜ly tr龃sgenesfun酬 resistaJlceare tow盯ds reinforcememof cell