胚胎干细胞的分离培养和定向分化的研究.pdf

摘 要 目前，胚胎干细胞的研究主要集中在分离纯化、扩增技术和定向诱导分化几个方面。本研究 以胚胎干细胞作为研究对象，研究内容共分以下两部分： 第一部分主要是猪胚胎生殖细胞(EG)的分离培养研究。本实验室采用STO细胞作饲养层， 在培养基中添加分化抑制因子的方法，已成功分离培养获得猪的EG细胞。为进一步探索猪EG 细胞更为理想的培养体系，并获得能够稳定传代的EG细胞系，第一部分以三个实验展开了对猪 EG细胞体外培养条件的进一步研究。 实验一研究了条件培养基对猪EG细胞分离培养的影响。在原代分离猪PGCs的过程中，可 此，分别收集两种细胞的培养液制成条件培养基，用来培养猪的EG细胞。分别使用两种条件培 养基或将条件培养基与STO饲养层细胞联合使用来分离培养猪的EG细胞，结果发现条件培养基 必须与饲养层细胞联合使用，才能维持EG细胞的增殖未分化状态。 实验二研究了Knockout培养基对猪EG细胞分离培养的影响。本实验共分三组，其中实验组 l为KnockoutDMEM与Knockout 均添加了细胞生长因子。结果表明实验组I与对照组都可以获得能够传代的EG细胞，实验组I 培养效果好于对照组；而实验组Il不能维持EG细胞稳定传代。因此，KnockoutDMEM与Knockout SR组成的Knockout培养基可以用于分离培养猪的EG细胞。 实验三将PC-Cs与同源胎儿成纤维细胞共培养分离培养猪的EG细胞。培养获得的细胞经AKP 染色，SSEA-1免疫荧光染色，转录因子Oct．4免疫荧光表达，核型分析，体外分化实验及电镜观 察等多种方法进行鉴定，证明其具有胚胎千细胞的特征。因此，PGCs与同源胎儿成纤维细胞共 培养的方法可以用于分离培养猪EG细胞。 第二部分以小鼠ES细胞作为研究对象，分三个实验对不同诱导剂在胚胎干细胞定向分化为 胰岛素分泌细胞(IPCs)中的作用以及基因转染方法诱导ES细胞分化为IPCs进行了初步探讨。 腺发育相关的重要基因Pdxl的表达量上调，但诱导两周仍未能获得大量IPCs。 过RT-PCR未能检测到IPCs相关基因的表达。实验结果表明，在本实验条件下，向培养基中单一 添加bFGF并不能有效地诱导小鼠ES细胞向IPCs分化。 实验三采用基因转染的方法将Pdxl基因与Isll基因导入小鼠ES细胞诱导其分化。转染24h 量明显上调，但是仍未检测到其它IPCs相关基因的表达。这一结果表明，转染时间不够，转染 24h后过表达的基因未能诱导小鼠ES细胞的分化。但是由于过表达效果明显，如果添加其他诱 导剂在培养基中，继续传代培养，将会有比较好的诱导结果。 关键词：胚胎干细胞，胚胎生殖细胞，增殖，分化，诱导 Abstract Now，theworkof stem(ES)cellsfocusedonisolationand Embryonic mainly and and wereresearch this differentiation．EScells in research enlarge，inducement objectivestudy，the workincludedtwo parts： One oftheresearchwas and had part isolatingculturingporcineembryonicgerm(EG)cells．Wegot EGcellswhen PGCsonSTOfeedercellsand differentiationactivities porcine plating adding inhibitory (DIA)inthemedium．Tofind culture and successiveEGcellslines，this optimizationsystemget part