串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫苗的构建及免疫原性的研究.pdf

串联不同分子佐剂的小鹅瘟病毒VP3基因疫 苗的构建及其免疫原性研究 中文摘要 小鹅瘟(GoslingPlague)是严重危害水禽养殖业的重要传染病之一，其防制措 施主要依靠疫苗接种，传统疫苗在预防和控制小鹅瘟时，存在着散毒和免疫应答不 完全等缺点。基因疫苗符合未来疫苗的发展方向，具有安全和诱导全面的免疫应答 Parvovirus， 等诸多优点。本研究以小鹅瘟病毒(Goose GPV)VP3为研究对象， 构建了VP3单基因DNA疫苗，为了增强VP3基因疫苗的免疫原性，将鹅白介素．2 (Goose 免疫刺激序列，将构建的三种基因疫苗分别免疫28日龄雏鹅和种鹅，并对其诱导 鹅产生的体液免疫和细胞免疫进行了比较研究，为研制高效小鹅瘟病毒VP3基因疫 苗打下了基础。 1．为了探索GPVVP3基因构建基因疫苗的可行性，通过PCR扩增和基因重组 技术克隆了GPV 游的Hind[[I和BamHI酶切位点之间，构建了单独表达GPVVP3基因的基因疫苗载 转染后48h检测到VP3基因的高效表达。 extention 2．通过重叠延伸PCR(Splicingbyoverlap PCR)扩增gm2一VP3串联 基因，包含缺失了T从终止密码子的g几．2基因和缺失了ATG起始密码子的VP3 下游Hin砌和BamH I酶切位点之间，构建了表达ejL2．VP3融合基因的 生物活性可达31．57U／ml。 II 生物活性可达31．57U／ml。 载体上，然后亚克隆定向插入到pcDNA．gIL2．VP3目的基因终止密码子后的 BamH I和Xba 鹅外周淋巴细胞增殖具有较强的刺激活性(SI=3．06)。 凝血，分离外周血淋巴细胞后，利用MTT比色法检测ConA对鹅外周血淋巴细胞 第28d体内细胞免疫最强，200“g DNA疫苗提前 pcDNA—glL2一VP3／CpG两种基因疫苗细胞免疫的峰值比单基因VP3 7d。 学一 采用间接ELISA的方法检测鹅体内IgG的动态变化规律，结果显示， pcDNA-VP3单基因组，这两种基因疫苗的各个剂量组均在第35d抗体水平达到最 高，其中以200¨g 看，均优于pcDNA．VP3免疫鹅和GPV弱毒免疫鹅。 6．将三种基因疫苗以200“g的剂量免疫28日龄鹅，分别于免疫后第15d、30d、 45d、60d和75d，采用微量血清中和试验检测基因免疫所诱导的中和抗体水平，结 果显示，免疫后第15d就可以检测到中和抗体，鹅血清中和抗体随时间的推移稳定 清中和抗体平均效价分别达到峰值1：178．5和1：198．2，二者之间差异不显著，但 是显著高于pcDNA．VP3和GPV弱毒免疫鹅(砌。05)。 7．将三种GPVVP3基因疫苗以200 lag的剂量肌肉注射免疫开产前母鹅，分别 体的检测，另外在免疫后第14d、28d、42d取一批鹅蛋入孵用以孵化小鹅用作雏鹅 攻毒保护试验。结果显示不同时间卵黄抗体和中和抗体水平与雏鹅攻毒保护率呈现 GPV弱毒苗的免疫保护效果。 关键词：小鹅瘟病毒，VP3基因，鹅白细胞介素-2，CpG序列，融合表达，免疫原 性，细胞免疫，体液免疫 IV Abstract V13 anandtlle esConstructionoofGooseoParvoviarvoviruseVP3hVaCClnesvaccinest