细胞培养基本技术-.ppt

冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。 慢冻程序 4 ℃ 10 分钟 －20 ℃ 30 分钟 －80 ℃ 16 - 18 小时(或隔夜) 液氮罐长期储存。 细胞复苏方法 （1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37 ℃ ～ 38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。 低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂。 冻存液： 含20%血清培养基和10% DMSO（或10％甘油） DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细 胞。 细胞欲冷冻保存时，细胞浓度应该多少？ 冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml 为宜。 七、细胞培养的污染和检测 细胞污染的种类 细菌、真菌、酵母菌、霉菌和病毒 污染源 无菌操作技术不当 操作室环境不佳 污染之血清 污染之细胞 细菌污染 细胞培养常见的污染 最常见的有：大肠杆菌、枯草杆菌、假单胞菌、白色葡萄球菌。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。 真菌污染 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。 细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。 支原体污染表现 荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体 支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状 白色念珠菌污染 Concentrating Cells Protocol To concentrate cells from a suspension culture (or resuspended cells from monolayer culture): Transfer the cell suspension to a sterile centrifuge tube of appropriate size and centrifuge for 10 minutes at 800 × g.Note:? Certain cell lines are very sensitive to centrifugal force. Carefully remove the supernatant without disturbing the cell pellet. Add the desired volume of fresh medium gently to the side of the tube and slowly pipette up and down 2 to 3 times to resuspend the cell pellet. Transfer the cells to the desired, sterile container. Thank you! 谷氨酰胺 细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。 一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。 配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 谷氨酰胺双肽，如甘氨酰基谷氨酰胺。这种谷氨酰胺在溶液中稳定，并可与谷氨酰胺一样有效地被细胞利用。 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS： NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4