抗猪心肌肌球蛋白单克隆抗体制备与在心肌损伤诊断中应用及研究.pdf

中文摘要 中文摘要 急性心肌梗死(AM[)、不稳定心绞痛(UAP)、急性冠状动脉综合征((ACS)等心血管疾病引起 的心肌损伤是危害人类健康的头号杀手，如能早期发现将对患者具有重大意义。但由于心肌 结构及功能的特殊性，早期心肌损伤的检测受到较多的限制，多年来寻找诊断心肌损伤的各 种生化标志物及其诊断方法一直是医学L:作者努力探索的课愚，但至今仍然没有一种能够完 全满足临床需要的诊断标志物和诊断方法. 本研究在查阅大量文献资料和进行广泛的临床调查的基础上，选择心肌肌球蛋白作为心 肌损伤的诊断标志物，围绕抗心肌肌球蛋白单克隆抗体的研制，开展了三个层次的研究工作。 抗心肌肌球蛋白单克隆抗体的制备心肌肌球蛋白(CardiacMyosin,CM)用于心肌损伤的 诊断，较心电图和其它血清酶或肌红蛋白更敏感和特异。在心肌受到损伤或酸性PH时，由心 肌肌球蛋白构成的粗肌丝发生裂解，CM轻链(CMLC)和重链 (CMHC)释放入血，CMLC出现 早且持续时间长，CMHC的结构特征决定其具有良好的特异性，所以心肌肌球蛋白的测定是 迄今为止诊断心肌损伤和研究心肌损伤及保护较特异的生化指标，可用于AMI的早期诊断和后 期治疗观察，由于猪与人的CM氨基酸序列存在99%以上的同源性，而人类心肌肌球蛋白抗原 难以获得，所以我们采用猪CM代替人CM作为抗原免疫小鼠，经过七次融合，采取间接ELISA 方法，从3000多个孔中筛选出14株，分别来自5个不同融和孔的能稳定分泌高效价的抗猪心肌 肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。生物学初步鉴定结果显示，制得的单克隆抗体具有亲 和力高，特异性强等特点。为下一步诊断方法的建立奠定了良好的荃础。 心肌肌球蛋白双抗体夹心ELISA法的建立及初步应用 用制备的抗CM的单克隆抗体作为 第一抗体包被酶标板，辣根过氧化物酶标记兔抗CM多肚抗体作为第二抗体，初步建立了双抗 体夹心ELISA法，对血清中的心肌肌球蛋自可进行定性、定量地检测，利用标准曲线测定其最 小检测下限为0.3ng/ml，标准曲线在1.0^-20.Ong/ml范围内线性良好。初步应用于检侧30例急性 心肌急性心肌梗塞患者血清中CM水平。并与肌钙蛋白胶体金免疫层析试剂卡同期比较，表明 两种方法的符合率为84.8%,并具有良好的重现性和稳定性。 心肌肌球蛋白胶体金免痰层析诊断方法的建立及初步应用 成功制备了性能稳定、免疫学 活性好的金标CM多肤抗体，将其固定于玻璃纤维膜上作为显色渊;抗CM单克隆抗体结合于 硝酸纤维素膜上作为捕获抗体，制成免疫层析试纸条。该试纸条的检测灵敏度可达5ng/mle捡 测30例急性心肌梗塞患者血清CM水平，并与Roche肌钙蛋白胶体金免疫层析试剂卡比较，符 合率达81.8%。该试剂条在4℃下至少可保存7.5个月。 结论:本研究成功制备了抗猪心肌肌球蛋白单克隆抗体，并将其应用在心肌肌球蛋白的 诊断上，初步建立了ELISA方法和胶体金免疫层析试剂条法，研究表明这两种方法特异性强、 稳定性好、操作简便，对心肌损伤的早期诊断具有一定的诊断价值，可为临床提供很好的参 考。 关键词:心肌损伤 肌球蛋白 单克隆抗体 夹心ELISA免疫胶体金 ABSTRACT ，. 甲 ， .，.- ，，~ ... ~ - ~ ..一 ..，月 一 ，， ...一 DevelopmentofAnti-Porcine-CardiacMyosinMonoclonal AntibodiesandTheirApplicationforDiagnosisofIschemic MyocardialDiseases (CollegeofAnimalTechnology,SouthwestAgriculturalUniversiyt,Chongqing400716) Abstract Themyocardialinjurycaused妙Acutemyocardialinfarction(AMT),Acutecoronarysyndrome (ACS),Unstableanginapectoris(UAP)etal,andother