《厌氧真菌内切-β-葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达 Recombination and Expression of an Anaerobic Fungus Endo-β-Glucanase Gene in Trichoderma Reesei Cells》.pdfVIP

第25卷第4期 高校化学工程学报 NO．4、，01．25 2011年8月 JoumalofChemicaI of Chin雠Univ铘iti器 20ll Engin∞咖g Aug． 文章编号：l003·9015 2011 04．0637m6 厌氧真菌内切一p一葡聚糖酶基因在里氏木霉中的重组与表达 金欣。夏黎明 浙江大学化学工程与生物工程学系，浙江杭州310027 摘要：里氏术霉 乃icJio出硎，船订是重要的纤维素酶生产菌，为了显著提高其产酶性能，拟利用分子生物学技术构 建高产的基因工程菌株。将前期优化后的瘤胃厌氧真菌内切．口．葡聚糖酶基因矿2置于里氏木霉纤维二糖水解酶I强启 的重组质粒pcB艄。以里氏木霉zU∞2为宿主，采用优化的根瘤农杆菌介导转化技术将重组质粒转入经萌发处理的 分生孢子．以潮霉素B为抗性标记初筛到318个阳性转化子，进一步接种到以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的筛选培养 基上，复筛到8株生长较快的转化子。以重组转化子基因组DNA为模板，分别进行PCR检测，均可获得目的基因片 段，表明厌氧真菌内切．B-葡聚糖酶基因已整合到里氏木霉的染色体DNA上．在摇瓶条件下，分别对8个重组转化子 进行产酶试验，获得3个高产内切．p．葡聚糖酶活力的转化子．发酵培养96h时，发酵液的内切-p．葡聚糖酶活力最高 可达到126．3IU．mL．1左右，是出发菌株的4．23倍。研究结果表明：厌氧真菌内切-争葡聚糖酶基因已在里氏木霉细胞 中得到高效表达并实现了胞外分泌． 关键词：厌氧真菌；内切一p-葡聚糖酶：基因克隆；里氏木霉；胞外表达 中图分类号：Q556．9 文献标识码：A Recombinationand ofanAnaerobic Genein Expression FungusEndo—p—Glucanase ZW幽Dd匆朋馏足P嚣硝CeUs JIN ⅪA Xin， Li-ming ofChemical 310027，China Depar虹nent Engi肥ering锄dBioengi舱ering，Zheji锄gUniVersi劬H锄g吐ou t0 its Abstnct：打砌冽台删口陀P船fisa cellul雏e r．InOrderimproVeenz rmeproducnoIl， good produce t0Obtainrecombin锄ts仃ainwith int11is molecuIar study．An bi0IogytecllIlologyw弱adopted highyields betvveenZ陀P卵f Pcbhl w鹊insened s仃0ngpfomotcr 0ptimizcd锄神robicfungusendo-p-gluc锄a∞ge眦∥2 t0 Vectort0 teminator’fIlnherIig锄edpCAMBIAl300 includingsecretingsignalpeptidesequence 锄d c0粥仃uctarccombination witIl BresistarIcem破er．The w舔 pl弱midpCB·hF hygromyciIl pl继midpCB-tlF 仃孤sf0咖edint0Z愆P船fZU．02 tlle m眦r砒3l8 wercscreened 8凤 byhygromycinB，锄d ge姗inatedconidia雏staningpositive咖sfom锄ts on foundmrtller thecuIture 伊Owm仃锄s向rm锄临wercby rescreening plalesusing Z w嬲mru忙rconfirmedt11at h鹊been int0tllechromosomalDNAof c缸bonsource．It the∥2gene inte伊atcd 愆P髭l me8rccombi彻m仃aIlSfom锄ts byPCR锄alysis．Endo-p-舀uc锄aseproductionby w舔perfo册ed iII 3 wcrcobtained．AfIer96h rcspectivelyshaI ingn勰l s，锄dh蛐EGactiV毋仃觚sfom锄ts shaI ing-naSk ofEG me仃锄sf0册狮treachesl26．3 is fe咖entati0Ilt11e IU·札～，which hi曲estprodu讹nactiv时∞眦dby host showst11attIle锄∞robic the s仃ain．ThisresuIt 4．23-fold私hi曲∞tIla士of fhngus been iIlto7 理P韶fchr0啪∞mal ex廿aceIluIarSccretion． int