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bcl．2在抗镉致大鼠原代近曲小管细胞凋亡中的作用 摘要 镉(Cd)是重要的工业和环境污染物之一，可由食物链和饮用水进入人体， 对机体肾、肝、肺、睾丸、骨骼及血液系统均可产生毒性，其中肾脏是其损害的 主要靶器官。目前，国内对镉诱导肾细胞凋亡的研究较少，而且其机制至今也尚 未清楚。 因此，本课题通过用携带bcl．2基因的重组腺病毒(由增强型绿色荧 光蛋白EGFP标记)感染原代SD大鼠近曲小管细胞，研究Bcl．2蛋白在镉致 细胞凋亡中的作用及其机制。为进一步研究镉对肾毒性的机理提供科学依据。 1 SD大鼠肾近曲小管细胞原代培养方法的建立 本实验采用三种分离方法对SD大鼠肾近曲小管细胞进行培养。它们分别 牛血清、 5 EGF、100U／L青霉素、100 ng／mL 养液，培养于37℃、5％C02培养箱。 通过对三种培养方法的比较分析结果如下：A法，细胞36h后始见有细胞 从组织中伸出，细胞团块较多，贴壁量少，贴壁率30％，细胞生长不良，体积 大小不一；B法，细胞24h左右贴壁生长，但贴壁生长量较少，贴壁率40％， 细胞生长不整齐；C法，细胞于24h左右即可见到贴壁生长，贴壁率70％，细 胞基本能长满培养板，形态为多边形，体积较大，细胞团块周围生长出大量的细 胞。经多次重复试验发现，．C法是三种方法中最好的，细胞生长状况和细胞产 量均好于其他两法。 2 bel．2重组病毒滴度的测定及对原代近曲小管细胞的感染 于96孔培养板中，培养24h。分15组，每组2孔。每组加10此／孔病毒 液，浓度分别是： h后，在荧光倒置显微镜下观察产生绿色荧光的细胞数量，确 白对照。培养20 定计量孔(荧光细胞数少于5个)为第9孔(计为1U)；根据公式10：l稀 n+1 Ux10n-I／O．01mL=10PFU／mL，计算得到病毒滴度为 释的病毒滴度=1 1010 曲小管细胞数)的重组腺病毒感染原代近曲小管细胞。在荧光显微镜下观察，24 h后MOI≥50感染的细胞有荧光，说明腺病毒成功感染肾近曲小管细胞。 3镉致原代细胞凋亡及腺病毒介导的Bel．2蛋白对其抑制作用的研究 bcl．2在抗镉致大鼠原代近曲小管细胞凋亡中的作用 研究Bcl．2蛋白的抗镉致原代肾近曲小管细胞凋亡的特性。用含有及不含 tubule 有bcl．2基因的重组腺病毒感染SD大鼠原代肾近曲小管细胞(Proximal 氯化镉浓度梯度和作用时间梯度刺激细胞，经MTT检测细胞增殖的变化、 AO／EB双染法测定细胞凋亡率的变化、DNALadder测定DNA断裂情况以及 腺病毒感染的原代细胞中Bel．2蛋白的表达量明显高于其它细胞。通过MTT、 AO／EB染色和DNALadder测定发现，在镉诱导原代PTC凋亡的过程中，Bcl一2 过表达可以抑制细胞的凋亡。实验结果揭示，在镉诱导的细胞凋亡过程中，Bcl一2 蛋白表现出明显的抗凋亡作用。 关键词：肾小管上皮细胞，镉，重组腺病毒，bcl．2，细胞凋亡 Ⅱ bcl．2在抗镉致火鼠原代近曲小管细胞凋亡中的作用 Abstract all industrialandenvironmental Cadmium(Cd)isimportant foodchainand water，thatcausessever toa of drinking damagevarietyorgans the and isthe for including lung，liver，kidney，testisplacenta．Thekidneytargetorgan chronicCd