三氧化二砷对体外造血微环境中白血病干细胞表面粘附分子的影响.pdf

三氧化二砷对体外造血微环境中自血病干 细胞表面粘附分子的影响 硕士研究生：段永涛 指导老师：吴秉毅教授 摘要 研究目的 stem 白血病干细胞(Leukemiacells，LSCs)是白血病化疗后复发的根源， 现已明确白血病干细胞同造血干细胞一样定居在造血龛中。所谓造血龛主要是 由骨髓基质细胞、成骨细胞、内皮细胞等组成的三维造血微环境。据研究发现， 白血病干细胞可以与正常造血干细胞竞争造血龛，并将其改造成为适合自己生 存的病态微环境，然后造血龛再通过多种作用机制使白血病干细胞停留在细胞 周期Go期，逃避常规化疗药物杀伤作用。白血病干细胞要受到造血龛各种机制 保护的前提是其必须稳定的锚定于这种微环境之中，而粘附分子及粘附分子受 体就是将白血病干细胞固定在造血龛中的主要作用因子。因此，减少白血病干 细胞粘附分子的表达可能会促使更多白血病干细胞脱离造血龛，进入增殖分裂 周期，提高化疗药物的作用效果，这可能成为减少白血病化疗后复发的一个新 途径。在造血干细胞细胞表面已发现20多种粘附分子，按这些粘附分子的结构 特点可将其分成以下五类：(1)整合素家族；(2)免疫球蛋白超家族；(3)选 择素家族；(4)粘蛋白样血管地址素；(5)钙粘着素或称钙离子依赖的细胞粘 附分子家族；此外还有一些尚未归类的粘附分子，如CD44。VLA．4(CD49d) 是介导残留自血病和耐药的重要粘附分子，使用抗VLA．4(CD49d)单抗与化 疗联用可消除小鼠模型中的残留白血病。CD44属于未分类粘附分子，主要配体 I 中文摘要 是透明质酸，CD44可通过与受体结合的方式将白血病细胞锚定于骨髓造血微环 境中，有利于白血病细胞的增值，阻止分化。靶向CD44的单抗可使白血病干 细胞趋向于分化，这也证明通过阻断自血病细胞与造血龛之间的粘附作用可以 克服分化受阻，诱导细胞成熟。Vermeulen等发现用抗体阻断粘附分子VLA．4 因此我们选择CD49d、CD44作为观察指标。三氧化二砷具有诱导肿瘤细胞分化、 凋亡及细胞毒等作用，用于治疗急性早幼粒细胞白血病取得了突出的疗效，使 其可以获得治愈；有学者提出三氧化二砷可能通过降低PML基因而靶向清除慢 性粒细胞白血病患者体内的白血病干细胞【11。我们推测三氧化二砷可能通过某些 机制靶向清除患者体内的白血病干细胞，从而避免化疗后复发，但在其他类型 的白血病中，尚不明确三氧化二砷是否有协同清除白血病干细胞的作用。KGIa 细胞系来自急性髓系白血病细胞系，其分化程度低，细胞表型为CD34+CD38．， 对集落刺激因子无反应性，被认为是造血干／祖细胞系，也是体外研究白血病细 胞功能特性的有用模型。本研究拟用骨髓基质细胞模拟体外造血微环境，与 表达率的影响。 实验方法 l用全培养法分离骨髓基质细胞：在知情同意前提下，分别取正常人和白血病 mL，1000r／min，5 患者新鲜骨髓3．5 min离心，去除脂肪块，加适量含10％胎 牛血清的ctMEM培养基混匀，37℃，5％C02条件下培养。第2天半量换液，以 后2．3天换液1次，待细胞局部融合覆盖瓶底80％时用0．25％胰蛋白酶消化细 胞并传代。 2用正常人和白血病患者来源的骨髓基质细胞在体外模拟造血微环境，与KGla 细胞共培养：取活性较好，第3．5代对数生长期骨髓基质细胞，按2x104／cm2接 种于24孔板，37℃、5％C02条件下培养24h，PBS洗去未贴壁细胞；KGla细 胞调至1x105／mL，每孔2mL加入已铺骨髓基质细胞层上继续培养24h。 II 硕士学位论文 3 KGla细胞按100001-／孑L接种子96孔板单独培养，分别在对照组和药物组中加入 等体积PBS及不同浓度三氧化二砷(终浓度为0．50l-tmol／L，1．00lamol／L，2．00 lamol／L，4．00lxmol／L，8．00lamol／L)，终体积200“L／孔，每组设4个复孔，同时 设调零孔。培养24h后加MTT染液20