HLA-Ⅰ类肽四聚体制备和用于特异性CTL检测的优化的研究.pdf

博士学位论_更 HLA—I类肽四聚体制备和用于特异性CTL 检测的优化研究 博士研究生：阮光萍 指导教师：王小宁 摘要 背景和目的 T细胞是机体免疫系统最关键的细胞之，研究T细胞的识别、活化及频 数分布是现代免疫学基础研究及应用研究的一个最重要的环节。 T T cells，To) 细胞毒性T淋巴细胞(eytotoxiclymphocytes，CTL或cytotoxic 在T细胞免疫应答中发挥重要作用，CTL主要识别存在于靶细胞(如病毒感染 细胞或肿瘤细胞)表而的抗原多肽，这种识别受MHC—l类分子的限制。CTL 的主要生物学作用为参与抗病毒免疫、抗肿瘤免疫及移植排斥反应。但CTL体 外培养比较困难，扩增过程带来大量非抗原表位特异性的T细胞，缺乏精确分 析抗原特异CTL的频数以及快速分离扩增这类细胞的技术。 在甲个细胞水平研究抗原表位特异性T细胞是非常重要的。在过左，通常 用铬51释放测定法和有限稀释分析法来测定抗原特异’I、细胞反应，但这两种方 法耗时、费上、不敏感，而且不能在单个细胞水平上研究抗原特异性CTL。自 从】996年AIrma等发明了HLA—I类肽凹聚体的方法后，使得抗原特异CTL 的检测迈向了新的台阶，这个新方法更敏感，可以直接体外在单个细胞水平分 析抗原特异T细胞，而不需体外扩增，这样对体内免疫反应提供了更精确的描 述。该方法通过基因工稃技术去除了HLA—I类分子a链的穿膜区和细胞质尾， 把长度为15个氨基酸的BirA酶的底物肽(BSP)加在其的羧基端形成融台蛋 白，存体外按一定比例与特异的抗原肽片断和B2微球蛋白共孵育，形成折叠jF 确的构象，成为MHC肽复台物，再经过纯化，把生物素标记在底物肽的赖氨 酸残基上，再与标记藻蓝蛋n的链亲和素反应，形成一个标记藻蓝蛋白的链亲 和索与四个牛物素化的MHC肽复合物结合的四聚体。MHC肽四聚体通过模拟 摘要 抗原提呈细腿与抗原特异CTL卜的多个TCR结合，结合能力比MHC肽甲聚体 大大提高了，结合稳定性增强，不易解离，可通过灵敏度极高的流式细胞仪进 行检测。 但HLA—I类肽四聚体制备的过程中存在复性率低、步骤繁琐等缺点，而 且从国外进口，价格昂贵，国际间进行合同服务日、J，需要解决知识产权的问题。 在复性制各单聚体时，需要在复件液中加入尿素溶解的革链、轻链年¨肽，是三 种蛋白的同时复性过程，但经过在4。C搅拌复性48h后，最后得到的单聚体量 很少。我们需要找到一种能提高复性率的方法，使四聚体的制各成本降低。我 们设计了一种新方法是先将重链和轻链奄u步复性，再与肽折叠，经过两步复性， 重链和轻链与肽的折叠更容易了，因此单聚体的得率大大提高了。 四聚体制备时需要先将单聚体生物素化，再与标记PE的链亲和素反应才 能形成四聚体，步骤繁琐，价格昂贵。而且该技术足国外的专利，我们需要开 发自己的专利，用抗体来交联单聚体形成多聚体，简化交联步骤，降低成本。 由于卵黄抗体产量高，收集方便，我们决定制备抗HLA—I类分了的重链利轻 链的卵黄抗体，尝试用于交联单聚体，彤成抗体交联的HLA—I类肽多聚体。 由于抗原特异T细胞在外周血中的频数很低，用四聚体直接检测通常不到 PBL的l％，难以达到统计处理的要求，而且较低频数的抗原特异CTL使对比 和连续地评价不同病人的免疫功能非常困难。在临床上检测不同样本时，由于 抗原特异CTL的百分比很低，很难看出差异，因此我们需要优化人外周血单个 核细胞(PBMC)中的抗原特异CTL的榆测，用我们设计的方法，用表位肽刺 激PBMC使抗原特异T细胞的百分比增高。一方面，为四聚体的质量控制提供 了高百分比的阳性标本，另一方面，为抗原特异CTL回输的过继性免疫疗法打 下基础。用该方法用十刺激病人的标本，使频数较低的抗原特异CTL基数提高， 可更好地对比不同病人的特异CTL的反虑。 方法 目的蛋白在原核系统中以包涌体的形式表达，将表达HLA．A*0201重链 (He)和轻