实验性肺纤维化大鼠肺泡巨噬细胞STAT1信号传导途径研究.pdfVIP

中 文 摘 要 前 言 /细胞因子通常依赖转录因子STAT发挥炎症和免疫效应，因 此加胞因子的STAT信号传导途径与疾病的发生、发展密切相 关。肺间质纤维化是以肺泡及间质性炎症起病、继以肺泡结构进 行性损害、细胞外基质蛋白胶原沉积为特征的慢性炎症性疾病。 AM异常活化引起的细胞因子异常表达、细胞因子网络相互作用 在肺间质病(ILD)的发病中占有极其重要的地位。有关细胞因子 的STAT信号传导途径在ILD发病机制中的作用，目前国内、外尚 未见文献报 文以博莱霉素(BLM)致大鼠肺纤维化为模型， 观察AM内 信号传导途径的动态变化，以探讨其在ILD发 病机制中的作用，有可能为治疗ILD探索到新的途径。 实验 材料 国蠢箕鬓塑蒜藻淤健·康雌性Wistar鼠“50·中‘ 试剂:鼠抗大鼠STATI单克隆抗体购于TransductionLaborato- ries(USA)，批号:G16920.BLM购于天津太和制药有限公司，批 号:991005. 实验仪器:HERA细胞培养箱，Universal32R低温离心机， Luzex-F图像分析系统。 实验方 法 动物模型的复制及分组处理:体重190一2408的健康雌性 Wistar大鼠50只(中国医科大学实验动物部提供)，实验条件下饲 养一周，随机分为BLM模型组25只和生理盐水(NS)对照组25 只。分别经气管内灌注BLM(5mg/kg)和相同体积的生理盐水 “1· (0.2一0.3m1)后于第1,3,7,14,28天各处死5只。 AM的分离与纯化:氯胺酮(100mg/kg体重)腹腔注射麻醉大 鼠后开胸，暴露心肺，右心室采血处死动物，经肺动脉插管注人 PBS(49C，含0.6mMEDTAPH7.4)冲洗双肺至肺脏呈苍白胶冻 样，结扎左主支气管，右肺用PBS行支气管肺泡灌洗(BAL)5m1x 8，回收液集中于无菌瓶中，经双层纱布过滤后移至无菌离心管中， 离心((49C,1200rpmx15分钟)，收集细胞，计数。细胞悬液用含 10%Fcs(56℃灭活)的RPMI一1640培养液在培养瓶中经379C, 5%co100%饱和水蒸汽的细胞培养箱内孵育纯化2小时，弃培 养液，将贴壁纯化的AM作细胞涂片，丙酮固定10分钟，一70℃冰 箱保存备用。 肺组织病理标本的制作:BAL后结扎右主支气管，经气管向 左肺注人4%多聚甲醛，使胸膜展开，结扎气管后将左肺置4%多 聚甲醛中固定。在不同部位取材三块，常规制成5ti,m的石蜡切 片，备用。 免疫组化检测STAT1的活化和蛋白表达:-70℃保存的细胞 涂片室温放置半小时后PBS(PH7.4)冲洗5分钟x3，行ABC法 免疫组化染色。一抗STATI单克隆抗体工作浓度1:1000，二抗生 物素标记马抗鼠IgG工作浓度1:200,DAB显色巧分钟。苏木素 复染，中性树胶封片。肺组织免疫组化染色时一抗STAT1单克隆 抗体工作浓度为1:5000 结果判定:肺组织病理改变的判定根据文献提供的方法判定 肺泡炎程度。AM内STATI的活化和蛋白表达的判定参考有关文 献，即STAT1蛋白表达以胞浆染色呈棕褐色连续状或灶性颗粒状 分布为阳性;STAT1活化以STATI蛋白核移位表示，即经苏木素 复染后胞核染色仍呈棕褐色或黑褐色连续状或灶性颗粒状分布为 阳性。以PBS代替一抗为阴性对照。光镜下计数1000个AM中 胞浆染色阳性的细胞百分数和胞核染色阳性的细胞百分数作定量 分析。肺组织STATI蛋白表达采用图象分析系统进行分析。 统计学处理:采用SPSS统计分析软件，进行方差分析、q检验 和相关分析。百分数数据经平方根反正弦转换后再进行统计学分 析。P0.05有统计学差异，P0.01有显著统计学差异。 结 果 肺组织病理变化:大体标本可见对照组双肺呈粉红色;模型组 可见双肺表面灶状分布的出血点，随时间延长上述改变由新鲜变 为陈旧，到第28天仍隐约可见。光镜下:对照组各观察点均无明 显改变;模型组首先表现为肺泡炎，随后发展为部分肺