甘薯NBS-LRR类抗病基因同源序列的克隆及分析.pdfVIP

摘要 甘薯NBS-LRR 类抗病基因同源序列的 克隆及分析 摘 要 甘薯 （Ipomoea.batatas ）广泛分布于世界各地，是重要的粮食作物。威胁甘 薯生产的主要病虫害有茎线虫病、黑斑病、青枯病和根腐病等，使用常规育种 方法选育甘薯抗病品种存在着育种周期长、效率低等不足，而利用分子生物学 等手段克隆出甘薯抗病基因然后基因工程方法培育抗病品种将是最有效的途 径。目前尚未有克隆得到甘薯的抗病基因的报道。NBS-LRR 类抗病基因是R 基 因中最为普遍的类群，NBS-LRR 类蛋白与植物抗病反应的发生有着直接关系。 NBS 区具有结合ATP 或GTP 的磷酸的功能，LRR 结构域在病原物识别方面发 挥重要作用。本研究依据NBS-LRR 类蛋白的P-LOOP 、GLPLA 两个基序设计引 物，对甘薯高抗茎线虫病品种“AB94078-1”、高感线虫病品种“徐薯18”及其 F 1 群体进行RGA 分离，共获得26 条新的甘薯RGA ，已提交至Genbank 数据库 并被接受。进行氨基酸序列推导后发现，获得的RGA 可分为具有TIR 和no-TIR 两种结构特征的NBS-LRR 类抗病基因同源序列，丰富了甘薯RGA 种类和数量， 进一步支持了前人关于双子叶植物基因组中存在 TIR 和 no-TIR 两种结构的 NBS-LRR 类序列的报道，而本研究所获得的 RGA 也可作为克隆甘薯抗病基因 的候选群体。利用DNAssist version1.0 软件对26 个RGA 进行氨基酸序列的推导 发现，R1100-AB 、R1100-16、R1100-34、R1100-79、R1100-169 等5 个序列除具 有NBS 结构域的4 个保守基序外，同时其C 端氨基酸序列存在LRR 结构，而 此前已报道的甘薯 RGA 均不具有 LRR 结构域。将本研究获得的 RGA 与 GenBank 数据库公布的甘薯NBS-LRR 类RGA 进行聚类分析显示，来源不同甘 薯品种的RGA 分属于不同的类群，新获得的 RGA 单独归为 2 大类，为R510 类群和R1100 类群，说明RGA 也可能从另一个方面为植物种群分化提供一定的 I 甘薯NBS-LRR 类抗病基因同源序列的克隆及分析 佐证。随后以R510-AB 为探针进行了Southern 杂交，结果显示分别经不同内切 酶消化的基因组杂交后均出现了多个条带，表明R510 类群在基因组中存在多个 拷贝。以克隆的甘薯NBS-LRR 类序列上样作标准对照，与经内切酶完全消化的 基因组DNA 同时上样进行Southern 杂交。利用Bandscan 软件扫描对比杂交条 带的强度，采用基因拷贝数的测定方法及公式经计算得出，在甘薯单倍体基因 组中R510 类群的序列拷贝数约为 17，得到了R510 类群在基因组中的具体拷贝 数，初步推测甘薯基因组中存在多拷贝的 NBS-LRR 类序列。为了进一步证实 NBS-LRR 类序列甘薯基因组中的多拷贝存在，本研究分别根据NBS 结构域第一 模体P-LOOP 及 LRR 结构域序列设计寡核苷酸探针，对甘薯基因组中NBS 及 LRR 结构的拷贝数进行了定量检测，同时优化了利用较小片段的寡核苷酸探针 进行 Southern 杂交的检测体系，初步得出在甘薯单倍体基因组中具有 P-LOOP 模体序列的拷贝数为83，具有LRR 结构域的序列的拷贝数为107。结果表明， 甘薯基因组中存在多个拷贝的 NBS 及 LRR 类序列，与已在其他作物中报道的 NBS-LRR 类RGA 在基因组中以多拷贝形式存在的结果相一致。NBS 及LRR 结 构域在基因组中以多拷贝存在，对抗病基因功能的发挥及识别多变的抗病位点 具有重要意义。甘薯基因组中NBS-LRR 类RGA 的多重复存在，一定程度上会 增大R 基因的进化空间，保证了其能够产生不同功能的NBS-LRR 类R 基因， 以抵抗不同地域环境下病原体的侵染。本研究应用寡核苷酸探针对未获得基因 组全序列的甘薯基因组进