如何固定化α-淀粉酶.pptVIP

* 实验6 α- 淀粉酶的固定化 及淀粉水解作用的检测 一实验目的 1、制作固定化α-淀粉酶 2、进行淀粉水解的测定 3、通过此实验探讨固定化酶的应用价值 关键词： α-淀粉酶 β-淀粉酶 糖化淀粉酶 糊精 红色 枯草杆菌 介质 固定化酶 固定化酶柱 吸附法、共价偶联法、包埋法、交联法 石英砂 KI-I2溶液 10倍柱体积的蒸馏水 1ml/min 0.3ml/min 一.实验目的 二.实验原理： 三.器具与材料 四.实验步骤 五.实验评价 1.酶溶液的不足： （1）酶在水溶液中不稳定，容易受影响； （2）一般不能反复使用； （3）不易与产物分离，不利于产物的提纯和精制。 思考题： 1、为什么要用固定化酶？ 2、什么是固定化酶 3、如何固定化α-淀粉酶？ 4、固定化酶有什么优点缺点？ 5、如何测定淀粉的水解作用 2.什么是固定化酶？ 就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。 介质的要求：惰性载体，不引起变性且能保持酶活性，对蛋白质要有高度吸附能力。 思考题： 1、为什么要用固定化酶？ 2、什么是固定化酶 3、如何固定化α-淀粉酶？ 4、固定化酶有什么优点缺点？ 5、如何测定淀粉的水解作用 3 将酶固定化的方法（掌握几种方法的名称） ②共价偶联法、交联法： 共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖等。 ①包埋法：将酶包埋凝胶内或微胶囊内。 最常用的凝胶有琼脂、聚丙烯酰胺等。 常用的半透膜有尼龙膜、醋酸纤维膜等。 ③吸附法：将酶吸附在载体表面上。吸附法常用的吸附剂有活性炭、多孔玻璃、硅胶、石英砂等。 将固定化酶装柱，当底物经过该柱时，在酶的作用下转变为产物。 ① ③为物理方法　　②为化学方法 思考：为什么α-淀粉酶可吸附在石英砂上? 因为本实验采用吸附法,该方法将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上,但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体,且对蛋白质要有高度吸附能力。自然界中有机硅胶、活性炭、石英砂等都可以用于做载体，现已了解到其中石英砂对固定化α-淀粉酶、胰蛋白酶的作用较好。 思考题： 1、为什么要用固定化酶？ 2、什么是固定化酶 3、如何固定化α-淀粉酶？ 4、固定化酶有什么优点？ 5、如何测定淀粉的水解作用 一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的 酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用 固定化酶 对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量 催化效率高 直接使用酶 不足 优点 类型 4、直接使用酶和固定化酶的优缺点 思考题： 1、为什么要用固定化酶？ 2、什么是固定化酶 3、如何固定化α-淀粉酶？ 4、固定化酶有什么优点？缺点 5、如何测定淀粉的水解作用 淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖 注意相应的酶和检测试剂以及颜色反应。 α-淀粉酶 β-淀粉酶 糖化淀粉酶 遇碘显蓝色 遇碘显红色 遇碘不显色 本实验内容是用吸附法将α-淀粉酶固定在石英砂上。一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精。用淀粉指示剂溶液（KI-I2溶液）测试，流出物呈红色，表明水解产物糊精生成。 这里使用的是枯草杆菌的α-淀粉酶，其作用的最适pH为（5.5-7.5），最适温度为50-75℃。 α-淀粉酶广泛分布于动物（唾液、胰脏等）、植物（麦芽、山萮菜）及微生物。 β-淀粉酶主要见于高等植物中（大麦、小麦、甘薯、大豆等），但也有报告在细菌、牛乳、霉菌中存在 。 淀粉酶种类很多。 固定化酶柱示意图 夹子 气门心 如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有α-淀粉酶？ 1、制备固定化酶时，不时搅拌石英砂和α-淀粉酶的目的？制备好后用什么冲洗？流速？目的是？ 2、如何证明洗涤固定化酶柱流出液中没有α-淀粉酶？ 3、淀粉水解作用检测时，滴管滴加淀粉的流速是多少？目的？ 4、为什么要用流出5ml后接收的流出液进行检测淀粉确实是固定化的α-淀粉酶水解作用的结果 ？ 5、用过的固定化酶柱用什么洗涤？保存于哪里可重复使用？ 1 2 3 4 1 2mL水+1~2滴KI-I2溶液 2mL淀粉液+1~2滴KI-I2溶液 2mL淀粉滤液+1~2滴KI-I2溶液 2mL淀粉滤液+1~2滴KI-I2溶液+稀释1倍 实验结束时的洗涤靠什么？放置在什么条件下几天后可重复上述实验？为什么？