白脊藤壶藤壶胶0k的基因克隆、表达及粘附功能研究.pdfVIP

摘要 摘 要 海洋粘附蛋白具有极强的粘接力、湿粘接特性和耐水性，可被用于制作水下 密封胶和粘合剂，不仅在国防和海洋工程领域应用前景广泛，而且还可作为生物 医用材料应用于临床。目前，研究比较多的是贻贝足丝蛋白(Mussel footprotein)， 美国公司已经研制出了细胞和组织粘合剂Cell．Tak。M。但是，贻贝足丝蛋白中存 在的糖基化修饰和序列中大量的修饰性氨基酸给进一步开发带来了很大困难，因 此，寻找一种新型高效易于开发的生物粘合剂已成为研究的热点。藤壶是一种固 着性海洋生物，它在水下分泌一种不溶性的藤壶胶粘附在外界材料上，这种永久 性的附着使它们能抵抗巨浪冲刷直至生命的终结。藤壶因其强的附着能力而备受 关注，藤壶胶蛋白由常用氨基酸组成，且不存在翻译后修饰现象，其不同于贻贝 足丝蛋白的附着机理及蛋白质结构的相对简单为进一步研究和开发藤壶胶蛋白， 使其成为新型、高效、稳定的生物粘合剂提供了一个新的研究方向。 红巨藤壶的20 kD蛋白(简写为Mrcp．20K)已经在体外重组表达，但是， 关于白脊藤壶20kD蛋白(简写为Bacp．20K)的原核表达及其功能研究未见报 道。本研究选用厦门湾分布广泛的白脊藤壶(BalanUSalbicostatus)为研究对象， 对Bacp．20K进行体外原核表达并对其功能特性进行研究，研究内容及结果简要 叙述如下： 从藤壶的新鲜组织中提取总RNA，逆转录后设计引物扩增出Bacp．20k基因， 本研究扩增的基因与NCBI报道序列的同源性为91％，序列中有15 bp的缺失突 变，但由其cDNA序列推导出的相应氨基酸序列仍然存在四组保守的半胱氨酸 重复序列，本研究蛋白氨基酸序列与报道序列比对缺失5个氨基酸，氨基酸排列 后组氨酸序列更加保守，由报道的一组重复序列增加到三组重复序列。将目的基 vector上，然后，将构建好的重组表达载体转化 因克隆到原核表达载体pET-32a 入大肠杆菌Ecoli Rosetta-gami(DE3)qb进行原核表达。 经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达SDS．PAGE结果显示，在由 Bacp。20k基因推导出的蛋白理论分子量的位置出现相应蛋白条带，且用免疫印迹 法(Western Blot)再次证实，带有六聚组氨酸标签的重组蛋白rBacp．20K能够 摘要 成功表达。经过摸索如下条件：蛋白诱导表达条件、菌体破碎条件等，最终使得 rBacp．20K菌体裂解液中可溶性蛋白与沉淀的比例约为l：l，即可溶性蛋白在总 蛋白中所占比例约为50％。 condition)下进行确保了表达纯化得到的重 蛋白纯化是在天然状态(Native 组蛋白与天然的蛋白结构绝大部分保持一致，经过亲和层析，纯化后蛋白纯度达 基因推导出的蛋白理论分子量一致说明，重组蛋白rBacp．20K表达纯化成功，蛋 白没有翻译后修饰现象。 对重组蛋t兰trBacp．20K的性质及功能检测的研究结论如下：扫描电镜(SEM) 英晶体微天平测量(QCM)结果表明，rBacp．20K在金片上粘附效果显著，甚至 比商业化产品的细胞和组织粘合完qJCell．础粘附量还要高；粘附功结果也较理 想；光电子能谱分析(XPS)结果表明，rBacp．20K选择性地粘附在铝片上，而 不粘附在玻璃、聚四氟乙烯及硅片上。 结论：本研究原核表达得到了功能性的粘附蛋白，该重组蛋rBacp．20K具 有较强的粘附能力表明，该蛋白具有成为在医学和水下环境中实用的抗水生物粘 合剂的潜能，该研究结果为开发新型的生物粘附剂提供了科学依据。 关键词：藤壶胶；rBacp．20K；原核表达：生物材料 II Abstract