第章蛋白质化学精品.ppt

2.SDS－PAGE 如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入0.1%的阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。 在SDS存在下，蛋白质变性，肽链伸展，SDS与蛋白质结合（每克蛋白质可结合1.4g SDS， SDS电荷量远超过蛋白质的电荷量?掩盖了蛋白质之间的电荷差异），使其都带负电荷。 /lehninger/ 3.等电聚焦电泳(isoelectric Focusing, IEF): 利用各种蛋白质pI不同，以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持物，并在其中加入两性电解质载体(carrier ampholytes)，在电场作用 　下，两性电解质载体按各 　自pI形成从阳极到阴极逐 　渐增加的平滑和连续的pH 　梯度，蛋白质在此pH梯度 　凝胶中泳动，当迁移至等 　于其pI 的pH梯度处时， 　被浓缩成狭窄的区带。 4.双向电泳 蛋白质分离纯化的主要方法 三、蛋白质分子量的测定 1.凝胶过滤法:先绘制标准洗脱曲线 2.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法 3.超速离心法 4.根据化学组成确定蛋白质最低分子量 如果蛋白质中所含的某一元素的量已知，则 　　　　　　　　　元素的原子量×100 蛋白质最低分子量＝ 　　　　元素的百分含量 真实分子量＝最低分子量×n 四、蛋白质纯度的鉴别标准 可通过电泳或层析的方法鉴定蛋白质纯度 纯度是相对的。 1.在不同pH条件下电泳，蛋白质呈现一条分离带。 2.等电聚焦电泳，蛋白质呈现一条分离带。 3.纯化后，蛋白质应保留活性。 4.在超速离心场中，蛋白质以单一的沉降速度运动。 五、蛋白质含量的测定 1.紫外吸收法 (1)A280吸收法： 原理：蛋白质分子中Tyr和Trp残基的苯环含有共轭双键，故蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(A280)与其含量呈正比关系。 特点：迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 (2)A280和A260吸收差法：当样品不纯，尤其含有核酸时采用此法： 蛋白质浓度（mg/ml）=1.45A280-0.74 A260 3.Folin-酚试剂法(Lowry法) 原理：蛋白质含有两个以上的肽键(-CO-NH-)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸-磷钨酸试剂)，蛋白质-铜络合物能还原磷钼酸-磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比。 特点：操作简便、灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10－20倍，较双缩脲法灵敏100倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。 4.染料结合法（Bradford法） 原理：蛋白质与考马斯亮蓝G-250反应?亮蓝色化合物，在595nm处有最大吸收。在一定蛋白质浓度范围内，吸收强度与蛋白质含量之间线性关系。 特点：该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。 5.微量凯氏定氮法 原理：被测的蛋白质与浓硫酸共热?NH4?，与硫酸反应?硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液，硫酸铵分解出氨。用蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中，再用标准酸溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量(mol)相当于被测样品中氨的量(mol)，根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。 Hb氧合与脱氧的构象转换： 血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。 （2）二磷酸甘油酸（BPG）可降低血红蛋白与氧的亲和力: 2,3-BPG的结构 BPG的产生： 葡萄糖 1, 3-BPG 3-磷酸甘油酸 2, 3-BPG 2, 3-BPG 磷酸酶（活性低） 二磷酸甘油酸变位酶 3-磷酸甘 油酸激酶 乳酸 2,3-BPG 旁 路 1967年，Reinhold Benesch和 Ruth Benesch发现，无BPG时，Hb与O2的亲和力强，BPG与Hb结合， Hb与O2的亲和力??。 BPG降低Hb与氧的亲和力的机理： （3）质子和二氧化碳促进血红蛋白释放氧: Bohr效应：1904年，Christian　Bohr发现，Hb与的亲和力依赖于pH，在生理pH范围内，降低pH可使Hb的氧合曲线右移。在pH恒定的条件下，增加CO2的浓度可降低Hb与氧的亲和力。 3.免疫球蛋白的结构与功能: 免疫球蛋白G(IgG)： 分子量150 000。 4.蛋白质分子的修饰和多肽链局部的断裂赋予它新的功能 胰岛素的加工 第五节 蛋白质的性质 一、蛋白质的水合作用和透析 1.蛋白质的胶体性质