第六章免疫组织化学精品.pptVIP

第六章 免疫组织化学 1.1 概 念 免疫组织化学（immunohistochemistry）: 将化学反应中呈色反应与免疫学抗原抗体反应结合起来，用标记的特异性抗体（或抗原）对细胞及组织内抗原（或抗体）的分布进行组织或细胞内原位检测的一门技术。 1.2 与组织化学的关系 从广义上理解： 免疫组织化学为组织化学的分支。 不同点： 组织化学的局限性：只能识别细胞或组织中核酸、蛋白质、酶、多糖、脂肪等，对免疫活化的大分子不能特异识别；方法上繁锁，不易掌握。 1.3 免疫组化在生物学中的应用 第二节 免疫组织化学的理论基础 免疫原性指的是它能刺激机体免疫系统产生免疫应答； 反应原性指的是它能与抗体或致敏淋巴细胞特异性地结合而发生反应。 2.1.2 分类 完全抗原:兼有免疫原性和反应原性的物质称完全抗原。大多数蛋白质是良好的完全抗原。 半抗原:只有反应原性而无免疫原性的物质称半抗原或不完全抗原，绝大多数低分子量的多糖和所有的类脂均属半抗原。 2.1.3 抗原的特异性 抗原具有与相应抗体或致敏淋巴细胞发生反应的特异性。这是由抗原分子表面具有化学活性的基团—抗原决定簇的性质、数目和空间构型决定的。抗原决定簇能被免疫活性细胞所识别，能与相应抗体的可变区结合。 2.1.4 抗原的异物性抗原化学结构必须与宿主自身物质的化学结构相异。 ①异种物质。如鸭血清蛋白对于兔为强抗原，对于鸡则为弱抗原。 ②同种异体物质。如人类的ABO血型的抗原物质； ③自身抗原。如被血——睾屏障所严密封闭的精子所含的物质。 2.2 抗体 2.2.1 定义 抗体(antibody)是机体在抗原物质刺激后，通过体液免疫应答，由浆细胞合成并分泌的仅与该抗原发生特异性地结合的球蛋白，称免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，存在于血液、淋巴液和组织液中。 抗原与抗体的结合具有高度特异性，抗体结合抗原的不同特异性，取决于轻链和重链的可变区氨基酸的种类和顺序的不同。 2.2.4 抗体的分类 目前，根据制备的原理和方法可分为多克隆抗体、单克隆抗体及基因工程抗体三类。 多克隆抗体（第一代抗体） 将一种天然抗原经各种途径免疫动物，由于抗原性物质具有多种决定簇，故可刺激产生多种抗体形成细胞克隆，合成和分泌抗各种决定簇的抗体分泌到血清中，故在其血清中实际上是含多种抗体的混合物，称这种用体内免疫法所获得的免疫血清为多克隆抗体（多数抗血清系由家兔制得）。 单克隆抗体（第二代抗体） 由识别一种抗原决定簇的细胞克隆所产生的均一性抗体，称为单克隆抗体，具有特异性强、纯度高的特点。应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体（多数单克隆抗体由小鼠制备）。 基因工程抗体（第三代抗体） 将对基因结构与功能的了解与DNA重组技术相结合，根据研究者的意图在基因水平对分子进行切割、拼接或修饰，甚至是人工全合成后导入受体细胞表达，产生新型抗体。 第三节  免疫组化染色方法及原理 3.1.1 标记抗体法（荧光素标抗体法或酶标抗体法。 1941年Coons建立了荧光素标记肺炎双球菌粘多糖抗体。 60年代Nakane建立了酶标记抗体技术 3.1.1.1 直接标记法 直接用荧光素或辣根过氧化物酶标记特异性抗体，与组织切片中相关抗原结合，用荧光/普通显微镜识别荧光所在的部位或酶显色的部位，以确定抗原所在的部位。该方法简单，但购买标记特异性抗体较困难，目前已经较少使用。 3.1.1.2 间接标记法 将未标记的特异抗体（第一抗体）与组织中抗原相结合，为了观察其结合部位，用荧光素或HRP标记第二抗体即标记在抗第一抗体的免疫球蛋白上再与第一抗体结合，如第一抗体为兔血清，第二抗体必须为其他动物抗兔的免疫球蛋白抗体。 优点：只要不同的第一抗体均来自同一种属，同标记的第二抗体结合就能用来显示其不同特异性抗原的存在，这样可避免了直接法中标记每一种第一抗体的麻烦，并且提高了方法的敏感度。 缺点：酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性、抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。 3.1.2 非标记抗体酶法 70年代Sternberger改良并建立了辣根过氧化物酶---抗过氧化物酶复合物法（PAP）技术。 辣根过氧化物酶（HRP）是从辣根中提取的，分子量为40000，等电点3～9，最适PH为5，它的底物是3，3ˊ-二氨基联苯胺（DAB）， HRP使DAB氧化形成棕黄色产物，可在光镜和电镜下观察。 HRP