即墨野生大豆(lycine soja Sieb.et Zucc)的营养评价及其胰蛋白酶抑制剂的研究.pdfVIP

摘 要 的痕量检测。 （3 ）等电点沉淀法得到的WSTI 粗品，其抑制剂活力为 9.86 U/mg，该值高 于同法处理得到的市售栽培大豆抑制剂活性。先用 Sephadex G-50 凝胶过滤层析 得到两个蛋白吸收峰，第二个峰 W2 峰有抑制活性，活力为 54.69 U/mg；再用 Sepharose 4B 亲和层析得到一个吸收峰W23 ，活力为552.85 U/mg；最后用Pellicon 5000 超滤膜进行浓缩，透析除盐及小分子杂质后，测得活力为 672.06 U/mg 。样 品经冷冻干燥，得到粉末状纯品WSTI 。经上述几步分离纯化，纯化倍数可达68.16 倍，活性回收率为 44.46% 。 （4 ）紫外光谱扫描显示WSTI 在 220 nm 和 280 nm 处有最大吸收峰。WSTI 具有较强的耐热性和耐酸碱性，对还原剂（DTT ）耐受性较强，对其他变性剂， 如尿素、盐酸胍、二硫苏糖醇等，也有不同程度的耐受性，说明 WSTI 是一种稳 定性较强的胰蛋白酶抑制剂。抑制动力学研究结果表明，WSTI 为竞争性可逆抑 制剂，抑制常数 Ki 为 0.21μmol/L，远低于 Km 值，是一种抑制活性较高的抑制 剂。高效液相色谱法分析可知，所得纯品WSTI 包含两个峰，分子量分别为 9.2 kDa 和 23.0 kDa，即 Bowman-Birk 型（BSTI ）和Kunitz 型抑制剂（KSTI ），其中主 要为 B 型胰蛋白酶抑制剂，而 K 型含量极少（约占 5% ）。采用MTT 法，测定不 同浓度的WSTI 对肿瘤细胞增殖的影响，在 0.1 μg/mL~1 mg/mL 的浓度范围内， 对 A549 肺癌细胞无显著性抑制效果。 （5 ）从野生大豆中提取出总 RNA 后反转录，再经巢式 PCR 扩增出 KSTI 和 BSTI 目的条带，扩增产物大小分别约为654 bp 和 357 bp 。 即墨野生大豆 KSTI 基因序列的起始密码子为 ATG ，终止密码子为 TGA， 与已报道的野生大豆及栽培大豆相似性均达 99% 。由217 个氨基酸组成，相对分 子质量为 24031 Da，理论等电点4.847 。含有26 个碱性氨基酸、31 个酸性氨基 酸、78 个非极性氨基酸和 82 个极性氨基酸。氨基酸序列中含有 STI 家族的保守 序列，其中 80 位的丝氨酸和 90 位的精氨酸构成其活性位点。二级结构主要由 α 螺旋、延伸链和无规则卷曲组成，无规则卷曲比例最大。 即墨野生大豆BSTI 起始密码子为 ATG ，终止密码子为 TAA，与已报道的野 生大豆及栽培大豆相似性均达 99% 。由 118 个氨基酸组成，相对分子质量为 13016 Da ，理论等电点4.045 。含有 16 个碱性氨基酸、12 个酸性氨基酸、43 个非极性 ii 摘 要 氨基和 47 个极性氨基酸。氨基酸序列中含有 BBI 家族的保守序列，其中 62 位 的苏氨酸和 63 位的赖氨酸构成其蛋白酶结合位点，Cys60、Thr61 、Lys62 、Cys68、 Cys87、Ala88 、Leu89 、Qln94、Cys95 九个氨基酸残基构成其活性区。二级结构 主要由 α 螺旋、延伸链和无规则卷曲组成，无规则卷曲比例最大。 关键词：野生大豆；营养价值；胰蛋白酶抑制剂；分离纯化；基因克隆 iii Abstract Study on the nutritional evaluation and trypsin inhibitor of wild soybean (Glycine soja Sieb.et Zucc) in Jimo Abstract China is a country with the largest distribution of wild soybean in the world. Wild soyb