荧光分光光度术(Spectrophotofluorimetry).pdfVIP

荧光分光光度术（Spectrophotofluorimetry） 刘莹 北京大学医学部基础医学院生物物理系 [摘要] ：荧光分光光度术又称荧光光谱，它属于光谱技术中的一种发射光谱术。其原理是电磁 波和物质作用后，物质首先吸收电磁波的能量，然后再重新发射电磁波。荧光光谱技术在物理 学，化学，生物医学领域中与核磁共振，电子自旋共振，红外光谱等技术共同配合，在生物大 分子结构，膜生物物理，细胞生物物理等研究领域中，成为不可缺少的技术。 [关键词]：荧光 荧光光谱 量子产率 淬灭 荧光共振能量转移（FRET ） 1 引言 某些物质被一定波长的光照射时，会在一定时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个 时间比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光的矿物 ， 萤石(fluospar)而得名。 荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振 度等。荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用的样品 量很少，且测量方法简便。荧光光谱还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间过程过 程。 目前，荧光技术与荧光探针，流式细胞仪，光镊技术等结合，在生物膜，生物大分子领域 拥有越来越广的应用前景。 2 基本原理 一、分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从 不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化 学发光、生物发光等。物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光单重态和三重态：分 子中的电子运动包括电子轨道的运动和电子的自旋运动。分子中电子的自旋状态可用多重态 2S+1 描述，S 为总自旋量子数。若分子中没有未配对的电子，即S=0,则2S+1=1 称为单重态； 若分子中有两个自旋平行的未配对电子，即S=1，则2S+1=3称为三重态，用T 表示。通常的情 况下分子的电子处于最低的能级状态，用S0 表示。若分子受激发，其电子从基态的电子能级跃 迁到较高的电子能级，即激发态，用S1, S2……表示。 （一）荧光和磷光的产生 处于分子基态单重态中的电子对，其自旋方向相反，当其中一个电子被激发时，通常跃迁至第 一激发态单重态轨道上，也可能跃迁至能级更高的单重态上。这种跃迁是符合光谱规律的，如 果跃迁至第一激发三重态轨道上，则属于禁阻跃迁。单重态与三重态的区别在于电子自旋方向 不同，激发三重态具有较低能级。在单重激发态中，两个电子平行自旋，单重态分子具有抗磁 性，其激发态的平均寿命大约为10-8s，而三重态分子具有顺磁性，其激发态的平均寿命为10-4 ~ 1s以上（通常用S 和T 分别表示单重态和三重态）。处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式 或无辐射跃迁方式再回到基态。辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的发射；无辐射跃 迁则是指以热的形式辐射其多余的能量，包括振动弛豫（VR ）、内部转移（IR ）、系间窜跃（IX ） 及外部转移（EC ）等，各种跃迁方式发生的可能性及程度，与荧光物质本身的结构及激发时的 物理和化学环境等因素有关。下面结合荧光和磷光的产生过程，进一步说明各种能量传递方式 在其中所起的作用。设处于基态单重态中的电子吸收波长为λ1 和λ2 的辐射光之后，分别激 发至第二单重态S2 及第一单重态S1。处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化 过程返回至基态 。这些过程包括： 振动弛豫（Vibrational Relaxation, VR ）:它是指 在同一电子能级中，电子由高振动能级转至 低振动能级，而将多余的能量以热的形式发出。发生振动弛豫的时间为10-12s 数量级。 内转移 （Internal Conversion ，IC ）:当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，常发 生电子由高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。右图中指出，处于高激发单重态的电子，通 过内转移及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。