绿僵菌和蝗虫中有降解昆虫体壁功能蛋白酶基因的分离、克隆及功能研究.pdf

Ph.D. Dissertation of Chongqing University Isolation, Cloning and Verification of Cuticle-degrading Protease Genes from ∗ Metarhizium anisopliae and Locust Ph.D. Candidate: Zhang Wei Supervisor: Prof. Yuxian Xia Major: Biomedical Engineering College of Bioengineering Chongqing University Oct. 2007 ∗This work was supported by grants from the Hi-Tech Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology, P. R. China No. 2004AA246050, 2004AA246051 摘 要 农业害虫是造成农作物减产的主要原因，同时也给林业和牧业造成了巨大的 灾害。飞蝗是一种洲际性农业重大害虫，在我国，以东亚飞蝗[Locusta migratoria manilensis (Meyen)]分布面积广，危害最为严重。因而加强对飞蝗等农业害虫的研 究和灾害的综合防治，已成为关系我国经济发展和社会稳定的重要因素。 长期以来，化学农药在害虫的防治中起着主导作用，这将直接导致三大环境 问题：(1) 污染环境，残毒积累，最终危害人类健康；(2) 害虫抗药性直线上升， 使化学农药用量不断增加，导致恶性循环；(3) 杀伤天敌，破坏生态平衡，从而致 使害虫再猖獗和次要害虫上升为主要害虫。为了降低环境污染，减少或禁用化学 农药势在必行，开发高效、稳定的生物农药已成为当务之急。微生物杀虫剂具有 无公害、无残留、害虫不易产生抗性等优点，日益受到人们的广泛关注。而杀虫 真菌是昆虫病原微生物(细菌、真菌和病毒) 中最大的一个类群，具有直接穿透寄主 体壁和持续控制等优点，是其它微生物杀虫剂不可比拟的。绿僵菌是一种非常有 效防治蝗虫的杀虫真菌，但是同其它杀虫真菌一样，存在着致死时间长等不足， 影响其广泛应用。昆虫的体壁是抵御真菌侵染的第一道物理屏障，因而杀虫真菌 穿透寄主体壁的成功率和速度是影响其杀虫时间的重要因素之一。杀虫真菌依靠 酶解作用和机械压力穿透寄主体壁，在侵染过程中产生一系列的酶来降解昆虫表 皮，其中蛋白酶起着主要作用。因而，来源于昆虫病原真菌的这类蛋白酶基因， 已成为利用基因工程手段，构建高效杀虫真菌的重要毒力因子。 同时，除了昆虫病原真菌能产生降解昆虫体壁的蛋白酶外，昆虫自身也能产 生降解自身表皮的蛋白酶。在昆虫蜕皮过程中，昆虫会分泌大量蜕液，其中包含 以蛋白酶为主的一系列水解酶，来降解老表皮，并回收利用促进新表皮的合成。 因此，本研究以昆虫病原真菌绿僵菌和东亚飞蝗为材料，分离、克隆具有壳降解 功能的蛋白酶基因，并进行相关的功能验证、分析。为发展高效、安全的基因工 程杀虫真菌提供毒力基因和前期的基础研究工作，这对于发展真菌杀虫剂及提高 我国真菌农药产业的核心竞争力都具有重要的意义。同时，昆虫蜕液中的壳降解 蛋白酶，与昆虫的蜕皮具有重要的关系，这类蛋白酶的缺损，将导致昆虫不能蜕 皮，并最终导致死亡，是潜在的杀虫靶标。因此，研究昆虫壳降解蛋白酶基因及 功能，对于研究昆虫的蜕皮生理发育过程，以及以这类蛋白酶为靶标，建立新型、 高效、安全的杀虫剂筛选模型都具有重要的意义。主要研究结果如下： I (1) 根据已报道的绿僵菌PR1A基因保