马铃薯晚疫病水抗性相关基因stpk1、stlrpk1、star的克隆和功能分析.pdf

摘要 tuberosum 马铃薯(Solanum L．)是世界上第四大粮食作物，在全球工农业生产 中均占有重要地位。联合国宣布2008年为“国际马铃薯年，强调了马铃薯在全球 粮食系统中的重要地位。马铃薯的生产受到多种病虫害的危害，其中由致病疫霉菌 (Phytophthorainfestans)引起的晚疫病是最具毁灭性的病害。马铃薯晚疫病的抗性 通常分为垂直抗性和水平抗性。晚疫病原菌小种变异迅速，导致马铃薯晚疫病垂直 抗性并不持久。水平抗性是由微效多基因控制的非小种专化抗性，对不同的生理小 种都具有抗性，并且较为稳定、持久。但目前对于水平抗性机理的研究还很薄弱， 极大限制了抗性资源的有效利用。本研究旨在通过3个水平抗性相关基因的克隆和 功能分析，探索抗性机制，主要结果如下： 1)。该基因cDNA全长1779 bp，编码416个氨基酸。该基因全长gDNA序列中具 有5个内含子和6个外显子。用马铃薯二倍体群体PCCl将该基因定位于第Ⅸ染 色体。半定量RT-PCR结果表明，晚疫病病原菌接种1h后该基因开始表达，而且 可以持续表达36h： 2．用RACE的方法，从马铃薯水平抗性材料中克隆了一个新的富含亮氨酸重 复的类受体蛋白激酶基因StLRPKl(S_olanum 1)。该基因eDNA全长3137 _receptor-liket2rotein_kinases bp，编码796个氨基酸，具 有1个信号肽、5个亮氨酸模体、1个跨膜域、2个脯氨酸重复区和1个丝氨酸／苏 氨酸蛋白激酶域，与拟南芥(Arabidopsis 半定量RT-PCR结果表明，该基因在花和幼叶中表达水平较高，被晚疫病原菌强烈 诱导表达，并且受SA、MJ、ETH和ABA诱导时呈现不同的表达模式； 3．用RACE的方法，克隆了一个马铃薯富含锚蛋白重复结构域的基因Star (Solanum tuberosum_ankyrin—richrepeat)。该基因cDNA全长204714个 bp，编码5 氨基酸，与水稻(Oryza h 个锚蛋白重复域和1个环指域。半定量RT-PCR结果表明，晚疫病病原菌接种24 时，该基因开始表达，随后逐步增强；2至36 导，而只在24至36h受ETH诱导： 4．分别构建了CaMV 达载体。以马铃薯试管薯为受体材料，用根癌农杆菌介导法，将上述载体导入马铃 薯试管薯，分别获得“鄂马铃薯3号(E3)正义超量表达株系15个，“转心乌”(W) 明每个转基因植株有1．3个拷贝。晚疫病病原菌接种实验表明，与未转基因株系相 比，干涉株系更抗病，而超量表达株系更感病，说明StPKl基因为马铃薯抗病反应 中的负调控因子； 5．为了研究StPKl基因负调控马铃薯抗病反应的分子机理，考察了11个马铃 薯抗病基因在接种晚疫病原菌24h后在E3超量表达株系、E3和E3干涉株系中的 表达。结果表明，有5个基因在StPKl超量表达株系中表达减弱，而在干涉株系中 表达增强，这表明StPKl处于这5个基因的上游，且负调控它们的表达； h一 直持续到36h，而受其它因子诱导并不强烈。用SA处理马铃薯植株的第3复叶， 表达，这表明SA无极性地向上、向下传递信号。此外，被StPKl负调控的5个基 因也受SA诱导表达。由上述实验结果推测StPKl基因处于SA信号途径； 7．分别构建了CaMV 癌农杆菌介导法转化烟草，分别获得8个和7个转基因烟草株系，转基因植株晚疫 病病原菌接菌试验表明，接种5d后，与未转基因烟草相比，超量表达株系更抗病， 推测StLRPKl基因和Star基因为马铃薯抗病反应中的正调控因子。 关键词t马铃薯；晚疫病；蛋白激酶基因；富含锚蛋白重复基因；负调控； 信号途径 2