茶氨酸和茶氨酸成酶活性的毛细管电泳检测及酶学研究.pdfVIP

搁姜 荼氨酸怒一穆j#蛋酝蔟氨基酸，它在荟撬麟搂鳝时教会爨占茶#}于物质戆 1．2％一2．。％。选今为止，茶氨酸仅被发现存在于山茶科植物和一种荤体内，是具有生 物活性的次生代谢产物。荣氮酸除了在生物体内发挥缀要的生理、生化功能外，对人 葶彗动物逐其商缀好豹保健功姥翻药理捧溺，邂j毙不仅可以{乍为食品帮保键品中的添加 荆，而且在隰药行业有潜程的应用前景。 在茶氨酸的测定、提取、分离、制铸、合成和实际应用等方面已经取得了一些成 聚。1993年AbelianV。邋过酶发酵法成功遗实现了茶氨酸的工业纯大嫂模生产，但 所用的酶对乙胺的亲和力较低丽导致了产物中静乙胺残餐。为了鼠嘏本上解决荼氮酸 的生物合成问题，探讨与茶氨酸合成关系密切的酶一一茶氨酸合成酶尤显重要。早在 1963年SasaokaK．等就发瑷了该酶，著从生物化学角度于#了较为系统的研究。憾在 随后的40多年量茶氨酸合成酶静研究掇j莛甚少，茏蔟茶氨酸合成酶分子生貔学瓣信 虑几乎没有。为了探讨茶氨酸在茶树体内的生物合成的调控机理，指导茶树的分子育 瓣，探索茶氨酸生物合成的新途径，构建生产茶氨酸的工程菌，更好地开发茶氨酸在 食箍和医药上酌功效，本论文主要在茶畿酸及萁台残关键酶静硷溅秘裙步缝纯等方甏 开展了一系列工作。 研究了萦籽的培育袋4牛，从不同缒织中分离、提取茶氨酸合成酶，并初步探讨～ 整理位霹素对荼氮葭台袋慧表达麴诱零馋麓。试验发魏氍涉予为鬣律，萘籍在2G℃ 条件下培育2周时生长最好。通过制铸丙酮粉，利用丙酮和硫酸铵沉淀法，从不同 缴织部位中提取茶氨酸合成酶。证实了丙醣粉粗酶波中，茶苗根中的茶氨酸合成酶活 瞧终蠹蒺静莹露荼褥鳝畸黪7，i莹，器荚簧鑫囊含餐傻为嚣嚣豢豹I／4。运露承橱酸 没泡、避光培养处理茶籽，茶苗表现出最高的茶氨酸台成酶活性，为自然光条件下培 肖的荼籽苗中的酶活的4．7倍，说明避光和水杨酸慰茶氨酸合成酶表达具有诱导作 簿。 建立了胶柬电动力学亳细管电泳技术定量茶氨酸的新方法，阮国内目前报道的其 它方法快速、准确、经济、自动化程魔高。试验以2，4-二硝基敷苯为衍生化试剂， 9。5露酸缓冲渡孛终嚣25rain君虿驻褥垂§羧稳定懿在360hm瑟畜最大强 在50。C蕊pll 收峰的衍生化产物。研究了影响毛细谢电泳分离效暴的主要霞索，确立了毛缀祷毫泳 分离的最佳荣件：以0．03mol／LpH9．8凹硼酸钠为电泳缓冲液，内含2．5％的Brij35 鞫i舔麴雾蔼醇，压力避檬嚣誊露受§s，分离电压为28kV，分离瀑度势tT。C，分离臻 的石英毛细管总长度为65cm，有效长度为60cm，内径为50儿m。检测了不同茶样中 的茶氨酸含量，测定了茶氨酸定量方法的性能指标：线性范围为0．2-5．0mmo】／I 的可行性。 以胶束电动力学毛细管电泳技术定量茶氨酸为基础，论文还首次建立了一套茶氨 酸合成酶活性检测的新方法。与过去的同位素标记法比较，该方法不仅样品用量少、 效率高，而且特别适合多样品的高通量检测。通过优化茶氨酸合成酶最佳反应体系得 umol2一 出：在35℃下，在lml反应液中含有25umol谷氨酸、10umol乙胺、5 mol mol 2、100p 巯基乙醇、25“molMgCl Tris—HCl(DH7．5)、10uATP和0．4ml茶 氨酸合成酶提取液，精确反应20min时茶氨酸合成酶活力达最大。考察了酶反应体系 中可能影响毛细管电泳分离的各种因素。对茶氨酸合成酶纯化液样品进行活性检测， 验证了茶氨酸合成酶毛细管电泳法分析的可靠性。并研究了茶氨酸合成酶初步纯化液 5℃。 的部分酶学性质：稳定pH范围为7．O一8．0以及酶的t。／。为1 运用离子交换层析、凝胶过滤层析尝试了茶氨酸合成酶的进一步纯化，最终纯化 K报道的纯化结果提高了近30倍。 倍数是丙酮粉粗酶液的42．4倍，这比Sasaoka SDS—PAGE电泳图谱可见，含茶氨酸合成酶的蛋白质条带在逐步减少，取得了一定的 纯化效果。另外