茶氨酸合成相关基因的克隆与“新高”梨增殖体系的建立.pdfVIP

摘要 茶氨酸（又称 N­乙基­γ­L­谷氨酰胺，简称 Theanine）是茶中特有的氨基酸，不 仅影响着茶的滋味，而且还具有重要的生物活性，如降血压、抗癌、增强抗肿瘤药物 的疗效、保护神经、镇静安神、提高学习和记忆能力和抗疲劳的功效。本试验克隆了 茶氨酸合成相关的酶基因，同时建立了 “新高”梨的增殖体系，为人工培育茶氨酸梨 提供研究基础。  1、本试验利用 cDNA 末端快速扩增技术扩增茶氨酸合成相关酶基因的 3’端，设 2+  定了如下扩增体系： 模板 cDNA100ng，10×B  uffer(Mg  plus) 5µl，2. 5mmol/LdNTPs 8µl，  10µmol/L特异性引物 GSP47­1 （第二轮为GSP47­2）1µl、10µmol/L接头引物 UPM  （第二轮为NUP）1µ  l，LA  Taq DNA聚合酶 2.5U， 总体积 50µl。 扩增程序为：94  ℃ 3min；  94℃ 30s；70℃ 45s；72℃ 80s  ，14个循环，­0.5℃/cycle；94℃ 30s；63℃ 45s；72℃  80s，25个循环；72℃延伸 10 min。在此基础上克隆出长度约为 2.4kb 的序列。将该 序列与 GenBank 上已知序列比对，发现与葡萄的谷氨酸氨连接酶的核苷酸序列的相 似度达 81%。  2、反向 PCR技术 （IPCR）是对已知序列 DNA 的两侧未知序列进行扩增和研究 的方法。本试验应用IPCR方法克隆茶氨酸合成相关酶基因的启动子序列：即 20µl  反应液中包含 1µg模板、5 U 限制性内切酶Bsp1407，2µl 10×T buffer，2µl 0.1%BSA； 酶切产物环化自连体系：50µl体系中0.5 µg单酶切基因组 DNA，5µl 10×T4连接缓 冲液、5 U T4DNA连接酶，22℃连接过夜；IPCR 反应体系：50µl体系中约 50 ng 环 2+  化自连接产物、2.5µl 10×PCR Buffer、25mmol/LMg  5µl、10mmol/LdNTPs 1µl，  10µmol/L 引物对(第一轮 1S1­1S2，第二轮2S1­2S2)各 2ul、1U Taq 聚合酶。IPCR扩 增程式为：94℃  3min ，94℃  l min ，56℃ 1 min，72℃ 1min，循环 29 次；72℃延伸  7min。利用建立的IPCR技术克隆出茶氨酸合成酶基因 5’上游长度为 171bp 的启动子 序列，且该序列含有 TATA­box，该元件对基因转录的正确起始起着重要的作用。  3、本试验以‘新高’梨芽为外植体，研究了不同浓度植物生长调节剂对其离体增 ­1  殖的影响。结果表明适宜‘新高’梨离体增殖的培养基为 1/2MS + 6­BA 0.5mg.L  + IBA  ­1  ­1  0.2mg.L  + GA 0.5 mg.L  ，在此培养基上平均增殖系数达到 3.3。 3  关键词：茶氨酸，3’­RACE，反向PCR，‘新高’梨 I  Abstract  Theanine (γ­glutamyl­ethyl­amide) is a non­protein amino acid in tea. L­theanine not  only has a strong influence on the taste of tea and but also important biological activities  on human, for instance, blood­pressure decreasement, anticancer ability, neuroprotection,  calmness, study capacity and memo