家蚕Roadblock功能域基因和几丁质脱乙酰基酶基因的分子克隆与功能分析.pdfVIP

摘 要 转化生长因子Ij(transforrninggrowthfactor)超家族由一类结构、功能相关的多 胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建等方面起着重要作用。TGF．D家族成员 广泛存在于从果蝇到人等多种生物的各种组织中，对正常细胞、癌变细胞都有着 显著作用。随着对于TGFB信号通路研究的深入，其他的一些能够介导各种不同 的生物学反应的TGF B信号通路成员也将陆续得被发现。Jin等通过酵母双杂交筛 选鉴定出新的能够与TGF 力蛋白轻链。当细胞受到TGF13信号分子刺激后，Robl通过TGFB．RII磷酸化后 激活，激活的Robl与激活的Smad2／3结合并将它们招募到动力蛋白复合体上，最 因的表达，从而产生各种生物学效应。由于Robl基因的许多新功能还未全部解明， 通过研究家蚕中Robl基因的功能和产生的生物学效应，是解析Robl基因新功能的 有效途径。 TOR(雷帕霉素靶标)作为一种重要的调节基因，TOR汇聚了来自细胞内外的 营养、生长因子、能量和环境压力的信号，通过调节细胞周期、蛋白质合成、细 胞能量代谢等多种途径发挥重要的生理功能，在细胞的增殖、生长、分化过程中 起着中心调控点的作用。mTOR信号的失调会导致很多疾病中出现，包括癌症和 于TOR信号的激活是必需的。目前的主要研究都是集中在哺乳动物的细胞之中， 并且P14具体发挥功能的机制仍然不清楚，因此，研究它详细的功能具有重要意 义。 几丁质脱乙酰基酶(Chitin 解昆虫几丁质的重要酶类。几丁质经CDAs作用形成脱乙酰几丁质(或称聚葡萄 糖胺)，脱乙酰几丁质又可进一步被CDAs分解成氨基葡萄糖。昆虫几丁质脱乙 酰基酶的研究是近几年才开展的，对其作用与调控机制知之甚少。为了研究昆虫 CDAs作用机制及调控机理，探讨CDAs对昆虫生长发育的影响，我们采用了生长 发育特征明显、体内组织器官易于区分的大型模式昆虫一家蚕作为研究材料。对 家蚕CDAs基因结构、mRNA选择性剪切模式及不同剪切体表达差异进行了研 究。 本论文在分析大量家蚕组织EST数据、基因组数据等的基础上，利用 RT-PCR和RACE技术克隆了家蚕BmRobl基因、 8 因，并对BmRobl与BmCDAs基因的功能做了研究，具体研究结果如下： 基因，BmRobl cDNA全长序列由853 bp碱基组成，5’UTR和3’UTR分别为 cDNA全长序列由 60bp、469bp，ORF长294bp，编码97个氨基酸；BmPl4 1263bp碱基组成，5’UTR和3’UTR为176bp、709bpOI强长378bp，编码125 个氨基酸。利用生物信息学的方法解析氨基酸序列的结构与功能域信息，BmRobl 性只有9％，但BmRobl与脊椎动物的P14蛋白的同源性反而比家蚕自身高，具有 12％的同源性。在已知的物种中，Robl蛋白与P14蛋白的氨基酸相同率都在10％ 列相差很大，进化树分析暗示它们可能属于Robl超家族的2个不同亚家族。Robl 学功能上的差异。 ‘2、利用原核表达系统表达了BmRobl蛋白，制备了多抗，经westernblot检 测发现特异性良好，为下步实验做好了准备。 3、通过RealtimePCR技术对BmRobl基因组织特异性表达和时期特异性表 达进行了分析，发现BmRobl在家蚕组织中的差异表达，此基因在各组织中均有 表达，但在大脑、翅原基已及性腺中的表达水平较高。因为Robl在有丝分裂和减 数分裂过程发挥着重要的功能，且对轴突的运输和成精神细胞的生成至关重要； 而卵巢和精巢产生配子减数分裂旺盛，翅原基在胚胎后期需要进行有丝分裂，大 脑的信号指令需要轴突的运输；所以BmRobl在大脑、卵巢、精巢和翅原基中高 水平表达。我们还分析了不同发育时期BmRobl J基因在翅原基的表达变化。结果 显示BmRobl转录体在预蛹期的水平最高，在进入蛹期后表达水平下调。家蚕的 预蛹期和蛹期是变态期，在此过程中，一些组织发生程序性细胞凋亡，另一些组 织如翅原基通过细胞分裂激剧生长。BmRobl基因在家蚕变态期的表达变化显示