农杆菌介导转Bt+cry1Ah基因抗虫玉米的研究.pdf

摘要 摘要 目前在植物基因工程中常常需要转化来源于微生物的基因。这种原核生物的基因的编码 区序列使用的密码子多为植物使用频率很低的稀有密码子，这就可能导致基因在植物中的表 达量很低。而通过密码子优化可以显著地提高外源基因在植物中的表达。 Bt crylAh基因是本实验室从苏云金芽胞杆菌(Bacillus 的一种新型杀虫蛋白基因，其编码蛋白对鳞翅目害虫的杀虫活性强于目前使用的crylA类基 因，在实验室前期工作中已根据植物密码子偏好性对cryL4h基因进行过一次优化。 ．本研究首先利用一次优化的crylAh基因构建植物表达载体pAhmG，该载体以 2raG2一epsps为筛选标记基因，以草甘膦异丙胺盐作为筛选剂。利用农杆菌介导法转化玉米自 交系7_31幼胚，得到40株To代转化植株，其中14株经分子检测为阳性植株，对T1代植株 blot、ELISA等分子检测结果表明 进行了田间生物活性检测。通过PCR、RT-PCR、Western crylAh基因可以在玉米中表达，并稳定遗传。但是研究中发现得到的转基因事件CrylAh蛋 白的表达量比较低(最高仅为o．008％)并且在玉米中有降解的现象，这会影响到抗虫效果。 随后，对cry／Ak基因根据玉米基因密码子偏好性进行了二次改造，优化后的crylAh基 因与一次改造的基因序列相似性为75．95％。构建了两个分别含有crymlAh单基因0ITu蛐b)、 对To代再生植株进行Westernblot和ELISA检测。检测结果显示CrylA血蛋白在玉米中正确 的表达，最高达到0．045％；表达量较pAhmG转基因植株提高5．10倍左右。 本研究通过密码子优化方法提高crylAh基因的表达，并获得了对玉米螟有抗性的转基因 植株，对今后外源基因的高效利用、抗虫转基因玉米的研发奠定了基础。 关键词转Bl基因抗虫玉米；cryMh基因；农杆菌介导；密码子优化 Abstracl Insect-·Resistant Agrobacterium--MediatedTransgenic Maize Bt Gene HarboringcrylAh Abstract At some for werefrom codon presenttransgenesplantgeneticengineeringmicrobiology．The was rare couldleadto of codons，which microbiologygenes’codingsequencemostlyplant genes’ lowin could very plants．Codonoptimizationsignificantlyimproveforeigngenes’ expression in expressionplants． Bt wasanovelinsecticidal clonedfromaBacillus crylAh proteingene gene thuringiensis isolateBT8in its insecticidalto was China,and encodingpro