人肥大细胞羧肽酶ELISA检测方法的建立及真核表达载体的构建.pdf

中文摘要 【目的】 odl 1．建立人肥大细胞羧肽酶(hum觚mastc砌)0xyp印tid嬲e，llMC·CP)的双 抗体夹心ELISA检测方法。 2．构建11Mc．cP真核表达载体。 【方法】 1．hMC．CP的ELISA方法的建立 (1)按方阵滴定法进行双抗体工作浓度的确定 (2)重复性实验 (3)灵敏度实验 (4)利用上述建立的ELISA方法，检测临床血清标本中的hMC．CP。 2．hMC．CP真核表达载体的构建 (1)设计特异引物，扩增完整的hMC．CP编码区基因，亚克隆入真核表 达质粒pcDNA3．1，构建llMC．CP真核表达载体。 (2)设计特异引物，用人免疫球蛋白1c链的信号肽编码序列置换 hMC．CP基因自身信号肽编码序列，扩增产物亚克隆入真核表达质 粒pcDNA3．1，构建hMC．CP分泌型真核表达载体。 【结果】 1．成功建立了hMC．CP的双抗体夹心ELISA检测方法。 2．用建立的ELISA方法初步检测了尘螨过敏患者的血清和正常对照者的血 清，结果显示尘螨过敏患者血清中枞c．CP的水平显著高于正常对照血 清组(p0．01)。 3．成功构建带有自身信号肽编码序列的hMC．CP的真核表达载体。 4．成功构建了含人免疫球蛋白c链信号肽编码序列的11MC．CP的分泌型真 核表达载体。 【结论】 1．成功建立了hMC．CP的ELISA检测方法，经检索，目前国内外尚未见有 类似研究报道，为进一步研究hMC．CP的生物学功能奠定了基础。 2．分别构建了含有自身信号肽编码序列和人免疫球蛋白1c链信号肽编码序 列的hMC．cP真核表达载体，为进一步l吐讧C．CP的真核表达及其功能研 究奠定了基础。 【关键词】 肥大细胞，肥大细胞羧肽酶；ELISA；检测；表达载体；构建 2 Abstract 【objective】 1．Toestablish也e融ichELISA{；w humanmaStccll detI刚ng carboxyp印tidase(1llⅥC-CP)． 2．Tocolls_tnlctⅡle V嘲rofhMC—CP． eul【aryoticcXpreSsion 【Methods】 meELISAfor tllellMC-cP 1．Establish detecting oftlledouble枷bodies． tlle condiotion (1)Det锄inationoptimalwo出ng of唧eataMl畸． (2)Dete珊IiIlation of seIlsiti啊妙 (3)Dete衄ination le、，elofhMC—CP wi也hyperseIlsi帆吼鹋 (4)The i11恤s啪of雠pati饥ts wasdetected丽tllmeaboveELISA． oftIlc Vector 2．CoIlstmction eIlkaryoticexpression DNA hⅢn姐c幽xyp印tid嬲ew鹊锄plifiedby (1)111elh班铋t％coding PcR觚dsul妇onedint0 Ve咖r