犬传染性肝炎核酸疫苗免疫Beagle犬的体液免疫效果的研究.pdf

中文摘要 Ie；g的 犬传染性肝炎核酸疫苗免疫Beag 体液免疫效果研究 摘 要 canine ICH) 目的 犬传染性肝炎(Infectious hepatitis 是由犬传染性肝炎病毒(ICHV)引起的一种常见的急性败 血性传染病，传染性强，无明显季节性，各种品系，不同年 龄的犬均可被感染，尤其以六周龄至一岁以内的犬发病率 高，死亡率达10～40％，对养犬业和实验犬的饲养均可造 成极大的危害。预防本病发生的主要措施就是加强饲养管 理，严格兽医卫生措施和定期免疫接种。目前，在实验用犬 和其他养犬业，主要采取定期接种ICHV弱毒疫苗的方法。 核酸疫苗是近年发展起来的一项新的免疫技术，与传统 疫苗相比有诸多优点，被称为第三代疫苗。核酸疫苗免疫接 种后，可在动物体内诱导体液免疫应答，对动物产生免疫保 护作用。抗体是由抗原刺激B细胞经分化和增殖后产生的免 疫球蛋白，因此在机体接受免疫接种以后，检测机体的抗体 水平，成为评价机体免疫反应及疫苗免疫效果的一个重要体 液免疫指标。中和抗体是病原微生物侵袭机体后，所产生的 具有中和相应病原微生物及其毒性产物(毒素)，使病原微 生物丧失感染能力或毒力的抗体，是进行病毒感染机制研究 的重要工具。中和抗体水平的监测是反映疫苗免疫原性的一 个重要体液免疫指标。 核酸疫苗作为一种新兴的疫苗，大量实验表明在感染性 疾病、肿瘤等的预防和治疗方面具有很大的潜力。本研究室 中文摘要 特异性IgG抗体和抑制病毒感染的中和抗体。为确定此核 对Beagle犬进行免疫，对其体液免疫应答效果进行评价。 苗的有效性，为犬传染性肝炎病毒核酸疫苗的开发研究奠定 基础。 方法 1 质粒的提取及抗原蛋白的诱导表达和纯化 ．Loop，采用聚乙二醇沉淀法纯化质粒。并对提取的重组质 并诱导重组Loop蛋白的表达。用尿素溶解沉淀，采用镍离子 亲和层析柱纯化重组蛋白，透析、复性后浓缩目的蛋白。 2实验动物的分组及免疫 8、16周注射重组质粒pVAXl-CpG—Loop ／只／次，最后一次与相同剂量的抗原蛋白共免疫；4号、5号、 质粒免疫，抗原蛋白免疫于颈部皮下。79-犬：为已接种传 统疫苗对照。 3攻毒试验 中文摘要 在第3次接种6周后，对实验犬进行攻毒试验。取病毒 10。4卫3／O．1m1)，在麻醉状态下，通过口腔粘膜感染病毒，剂 量为1ml／只。 4免疫动物的体液免疫效果评价 间接ELISA法检测免疫犬特异性IgG抗体，以包被液稀释 的犬传染性肝炎病毒(1：5稀释病毒)，loo“l／孔包被酶联板，4 封闭，37。C于湿盒中放置lh；然后加入待检的不同稀释度的 涤3次；加入显色底物OPD溶液100“l／孔，避光显色；加入 50rd／孑L2mol／L 下的OD值(OD492)。以P／N大于1．8为阳性。 间接免疫荧光试验(IFA)测定血清抗体效价，免疫后静 脉采血，分离血清，将待测血清置56℃灭活30min，血清样 6 个稀释度，滴加于抗原片上，设PBS为空白阴性对照。在37 ℃温箱中孵育30min；PBS振荡洗涤3次，每次5min；加1：200 稀释度的羊抗犬IgG 后用蒸馏水冲洗，室温吹干；用90％缓冲甘油液封片，在荧光 显微镜下观察。 中和试验测定血清中和抗体效价：收集各犬的血清，灭 活后采用固定病毒．稀释血清法进行中和实验。用DMEM将 中文摘要 血清样品做连续倍比稀释。分别在上述血清中加入等量的适 常细胞对照；37℃，5％C02培养箱中孵育lh；弃去血清．病 毒混合液，用Hanks