两种方法对广玉兰ISSR—PCR反应体系的优化比较.pdfVIP

维普资讯 第27卷 第6期 2008年6月 种 子 (Seed) Vo1．27 No．6 Jun． 20o8 两种方法对广玉兰 ISSR—PCR反应体 优化比较 陈亮明 。相 阳 。张冬林 。 李志辉 ， 陈永华 ， 马倩 。 彭婧 (1．中南林业科技大学 资源与环境学院， 湖南 长沙410004； 2．山东省济宁市园林管理局科研所， 山东济宁272100) 摘要：采用单因子和正交设计2种方法，对影响广玉兰ISSR．PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2、dNTP、引模板 DNA)进行优化。结果表明：正交设计采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平与单因子试验找出影响因素最佳反应 水平有一定差异，通过综合比较分析，最终建立了广玉兰ISSR—PCR的最佳反应体系：在2O l的反应体系中，TaqDNA聚 合酶 1．0U、M 1．2—1．5mmol／L、dNTP1．80mmol／L、引物0．5—0．6x／mol／L、30ng模板DNA、10×PCRbuffer。同时，通 过PCR比较 ，确定延伸时间为2rain，循环次数为35个较为合适，确定了引物最佳退火温度 ，得到 了广玉兰 ISSR—PCR反 应的最佳扩增程序。 关键词： 广玉兰；ISSR—PCR；单因子试验；正交设计 中图分类号： S685．15 文献标志码：A 文章编号： 1001—4705(2008)06-0010-05 ComparisononTwoMethodsof OptimizationofISSR—PCRReactionSystemforMagnoliagrandiflora CHEN Liang·Ini ，XIANG Yang2，ZHANG Dong·liII，LIZhi·hui， CHENYong-hua，MA Qian，PENGJing (1．CoUegeofResourcesandEnvironment，CentralSouthUniversityofForestryandTechnology，Changsha410004； 2．ResearchAgencyJiningGardenAdministrationofShandong，Jining272100，China) Abstract：Theeffectoffivefactors(TaqDNApolymerase，Mg¨，dNTP，Primer，templateDNA)onISSR—PCR applicationsystem havebeen investigatedwiht singlefactortestsnadorthogonal designforMagnolia grandiflora．Theresultsindicatedthebestresponselevelhavesamedifferencesbetweensinglefactortestsand orthogonal desing ．~SR-PCR reaction system wasestablishedhtrough comprehensivecomparativeanalysis， namely20x／lreactionsystem containing1．0U TaqDNA polymerase，1．2—1．5mmol／LMg“，0．18mmol／L dNTP，0．5—0．6肛mol／，Lprimer，10×PCR buffer，30ngtemplateDNA．Th eextensiontimesetfor2minutes andnumberofcycleswere35．BetternanealingtemperaturesforISSR—PCR reactionofreachprimerwaspro— posedbyPCR．TheresultprovidedasatndardizingISSR—PCRprogr