啤酒酵母多糖的化工艺及结构鉴定.pdfVIP

谨以此论文献给我敬爱的老师、家人及我的朋友 ——付燕秋 啤酒麦芽极限糊精酶、蛋白抑制因子分离纯化及其两者相互 作用的研究 摘 要 极限糊精酶作为影响生产高发酵度、淡爽型啤酒的关键因素，在啤酒酿造中 起着举足轻重的作用。本研究对澳麦201106Gairdner 绿麦芽中的极限糊精酶及其 抑制因子进行了分离纯化，并对其两者性质作了初步研究。同时，在离体的缓冲 液体系中，初步探讨了两者之间的相互作用及还原剂DTT 作用结合态极限糊精 酶释放自由态酶的机制。该研究不仅为获得较高纯度极限糊精酶及其抑制因子提 供了有力的理论依据和可行的工艺方法，亦为国内针对性地深入研究啤酒麦芽极 限糊精酶性质提供了丰富的研究材料，还为啤酒糖化过程实现酶调控技术提供了 可靠的理论基础。 采用25%-35%-80%硫酸铵三步盐析、Sephadex G-25 凝胶过滤柱层析、DEAE sepharose FF 离子交换柱层析和Sephadex G-100 凝胶过滤柱层析，纯化得到麦芽 极限糊精酶，经 SDS和 IEF 凝胶电泳检测为单一条带，证明获得了极限 糊精酶纯品，分子量大约为 101.9kDa ，等电点pI 约为4.66 ；将每一步分离纯化 得到的蛋白质样品，以酪蛋白为标准，依据福林-酚法测定蛋白质含量，同时以 染色底物红普鲁兰法测定酶活力，计算各步骤的比活力、收率和纯化倍数，最终 极限糊精酶的纯化倍数为164.2，回收率为16.5%。 对麦芽极限糊精酶的酶学性质研究发现，其最适作用温度为50℃，热敏感， 当温度超过50℃时，酶活力迅速下降；最适pH 在5.5 左右，当pH 低至4.5 时 酶活力损失40% 以上，在pH5.0-9.0 的范围内基本保持稳定；此外，Ca2+ 、Mg2+ 、 Mn2+等金属离子对该酶有显著的激活作用，尤其是工业中常用的淀粉酶保护剂 Ca2+ ，在80℃下对极限糊精酶有良好的保护作用；对该酶的动力学性质研究表明， 以支链淀粉为底物，该酶的 K 值为 3.3426mg/mL ，最大反应速度 V 值为 m max 0.8456mg/minmL 。 I 采用粗提取、热提取、羧甲基纤维素 CM-52 离子交换柱层析和 Sephadex G-100 凝胶过滤柱层析，纯化得到两种极限糊精酶抑制因子混合物，分子量相近 大约为 15.8kDa ，等电点pI 分别约为6.76 和7.28，纯化倍数为39.9，回收率为 14.1%。 对麦芽极限糊精酶抑制因子的性质研究发现，其对极限糊精酶的抑制最适 pH 近5.5，其在广泛的pH 范围（pH4.0-8.0 ）内对极限糊精酶均有抑制作用；在 温暖（40 ℃）的环境中，有牛血清白蛋白（BSA ）和还原剂DTT 存在时，无活 性的极限糊精酶可恢复其活性，保温8h，活性可恢复约66.5% 。 在离体条件下对极限糊精酶调控机制的研究发现，在温暖（40 ℃）的环境， 有牛血清白蛋白（BSA ）存在的缓冲液体系中，还原剂DTT 可使结合态极限糊 精酶活力有一定程度的恢复；自由态极限糊精酶不是“巯基酶”；在离体的缓冲 液体系中，推测出一种还原剂DTT 作用结合态极限糊精酶释放自由态的假设， 即DTT 通过作用于被牛血清白蛋白（BSA ）激活或修饰的结合态极限糊精酶， 将其还原成自由态极限糊精酶。 关键词：啤酒麦芽；极限糊精酶；蛋白抑制因子；分离纯化；酶调控 II The Purification and Interaction between Limit Dextrinase and its Inhibitors from beer malt Abstrac