热刺激条件下血内皮细胞的形态变化及凋亡研究.pdf

摘要 热刺激条件下血管内皮细胞的形态变化及 凋亡研究 摘要 热疗作为一种治疗肿瘤的全新疗法，得到了广大研究者广泛的关 注。但是已有的研究都局限于热疗或者热疗结合其他疗法对肿瘤细胞 的损伤，血管内皮层作为肿瘤生长中营养和氧气供应的主要通道一直 被忽视。随着抗血管新生疗法的问世，血管内皮细胞在肿瘤治疗中受 到越来越多的重视。以新生血管为靶点，抑制肿瘤生长，阻断肿瘤的 营养来源和转移通道已成为近年来国内外研究的热点。本文主要从细 胞和分子水平研究热刺激过程中血管内皮细胞形态改变与血管渗透 性变化的关系，探讨热疗对血管内皮细胞的损伤，并探索引起其改变 的机理。 在临床上热疗可以增强化疗的疗效，但是对于引起此效果的机理 却很少有系统性的研究。我们课题组已有的研究工作表明热疗通过增 大血管的通透性，促进抗肿瘤药物在肿瘤部位释放从而增强其疗效。 本课题进一步研究了热刺激引起细胞形态改变与微丝骨架变化的关 系，通过体外加热血管内皮细胞发现加热后细胞形态变圆，细胞之间 的间隙变大，同时细胞之间的连接消失。通过对细胞微丝骨架的固定 染色，发现加热后，细胞内的微丝骨架发生了巨大的变化，有序的网 状结构消失，微丝聚集体散布在细胞内。同时，我们将GFP—actin质 摘要 粒转染血管内皮细胞后建立单克隆细胞系，利用该细胞系及激光共聚 焦荧光显微镜对血管内皮细胞进行实时观察，研究了加热过程中血管 内皮细胞细胞骨架的实时变化。结果表明，细胞微丝骨架的变化与其 形态以及细胞之间连接的变化几乎是同步发生的，说明了血管内皮细 胞形态以及细胞之间连接发生变化的内在原因是细胞内微丝骨架受 热发生了解聚。 热疗结合化疗除了对肿瘤细胞有杀伤作用外，其对血管内皮细胞 的直接杀伤作用也是热疗增强疗效的重要机制。我们进一步研究了热 刺激以后血管内皮细胞的损伤，结果显示血管内皮细胞在450c／j口热 以后，细胞的表面出现了大量凋亡小体。我们又用荧光双染色的方法 定量分析了血管内皮细胞在不同温度下细胞存活率、凋亡率和坏死率 随时间变化的情况，结果表明血管内皮细胞死亡的模式与温度的高低 密切相关：当温度低于45。C时，细胞的死亡模式以发生凋亡为主， 而当温度大于45。C时，细胞的死亡模式以坏死为主。已有的研究发 现热刺激以后肿瘤环境下的血管内皮细胞比正常血管内皮细胞死亡 率更高，对热的刺激更加敏感。我们通过进一步的实验证明温度处于 43—45℃时，肿瘤环境下的血管内皮细胞凋亡率要大于正常血管内皮 细胞。 除了本研究所涉及的热刺激引起血管内皮细胞微丝骨架以及细 胞发生凋亡、坏死的研究，已有的一些研究还对热刺激过程中血管内 皮细胞胞内钙离子浓度以及热激蛋白(HSP)水平变化等细胞水平的现 象进行了研究，但这些单因素的研究始终无法从全局和系统的角度探 摘要 讨热刺激对细胞的影响。为此，我们采用了大规模基因芯片的方法检 测受热刺激血管内皮细胞后基因表达水平的变化，发现在温热和高热 刺激的条件下都有大量的基因表达发生上调或者下调。随后又通过正 交分类以及基因语义学(GeneOntology)等分析方法，将统计上有基 因显著聚集的功能子类挑选出来，随后将这些功能子类的基因与已经 报道的实验现象进行详细地对比分析，找出了其中一些生理现象可能 的分子机制。其中包括细胞结构相关蛋白基因，如DNA结合蛋白，骨 架蛋白等：还有一些是细胞功能相关蛋白基因，如细胞信号转导相关 蛋白，还有细胞凋亡相关蛋白等。将这些现象与基因水平的变化联系 起来，为进一步研究这些生理现象找到了线索。 结合我们的实验结果，我们认为在热疗促进药物的热靶向输送研 究中，热疗除了引起血管内皮细胞骨架解聚改变细胞形态而达到抗肿 瘤药物在肿瘤部位大量渗透外，还通过细胞凋亡的方式引起肿瘤血管 的破坏，因此热疗具有双重的疗效，一方面促进了药物的渗透，另一 方面也造成了肿瘤血管的破坏，这两方面的作用同时增强了热疗结合 化疗的抗肿瘤效果。 本课题的开展具有重要的理论价值，从理论上解释了临床上热疗 能够加强抗肿瘤药物在肿瘤部位靶向释放以及热疗通过直接杀伤血 管内皮细胞达到杀死肿瘤组织的机制。同时热刺激以后血管内皮细胞 基因表达的研究可以较系统地解释