苹果蔗糖转运蛋基因mdsut1克隆及其互作因子筛选.pdfVIP

摘要 蔗糖转运蛋白是一类介导细胞跨膜转运蔗糖的膜蛋自，广泛存在于生物体内。糖在生物体内 的生产、运输、消耗和贮藏是一个由多种信号网络严格控制的过程，这个过群的调节服从丁细胞 的发育和对环境适应的需求，而糖运载蛋向是这个复杂网络中的一个重要组分或者调节者。到目 前为止，人们对植物糖运载蛋向功能调节的细胞信号过程几乎一无所知。本文在克隆苹果蔗糖转 蛋白一蛋白互作信号以及脱落酸(ABA)的调节，主要结果如下： Domestica (Malus Borkh 4．0 蛋白对蔗糖转运具有pH依赖性，当pH 5．0时转运活性最大。转运蛋自的J(1II值为0．63mmol／L， sucrose Vmax为6，54pmol min“mg～cells。 (IPTG)诱导4h，表达出31．5 aB--MdSUTI 融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫家兔，制得兔抗MdSOTl“抗体。真核表达载体pMET 转化酵母菌PMADl6(厅曲妇atethanolica)，经甲醇诱导4d表达山58kD的融合蛋白，然后通过 dot 抗体。酶联免疫(ELISA)、Proteinblot和Western blot分析结果表明，所制备的两种抗 体对苹果蔗糖转运蛋白有良好的特异性和较高的检测灵敏度。 利用Split UbiquitinSystem研究了苹果蔗糖转运蛋白的分子内互作，结果表明，苹果蔗 发生了蛋白一蛋白间的互作，说明其蛋白分子可能存在同源二二聚体结构。转基因酵母突变体 SUSY7／ura3蔗糖互补实验结果显示，MdSUTI，MdSUTl一I，MdSUTl (MdSUTl一I+MdSUTl一II)蛋白的蔗糖转运活性要比MdSUTl全长蛋白低。 首次获得了蔗糖转运蛋白互作的分子证据。以苹果蔗糖转运蚩白(MdSUTl)为“诱饵”筛选 当其突变成脯氨基酸时，MdSUTI不能与MdCyb5发生互作。 应用RealTimePCR和Western Blot的分析方法研究了苹果蔗糖转运蛋白基冈MdSUTl在转 V 录和翻译水平的表达以及ABA刺激苹果蔗糖转运蛋白表达的情况。研究结果发现，MdSUTI不仅在 苹果果实中表达，同样也在花瓣、枝条皮层、叶片、种子中表达。花瓣和枝条皮层的表达量最高， 果实和叶片次之，雄蕊和种子最低。随果实不同的发育进程，IIIdSUTI的表达在花后60d和花后 110 d达到高峰，而在花后30d和花后80 d则表达量下降。而翻译水平的表达与此基本相反。 首次发现ABA能刺激蔗糖转运蛋闩基因的转录和翻译。10mnol／L h ABA处理苹果果实圆片2 (pll 运速率。蛋白激酶抑制剂和蛋自磷酸酶抑制剂星孢菌素、环孢菌素抑制蔗糖转运蛋白基因MdSUTI 的表达，但没有引起蔗糖转运蛋向MdSUTI数量上的变化。说明在蔗糖转运过程中蔗糖转运蛋白 在转录和翻译后水平受到多重调节。 关铡酗司苹果(鼢』us肋∞Psfjca)，蔗糖转运蛋白，基冈克隆，蛋白质互作，ABA VI Abstract Sucrose membrane involvedinthecellular ubiquitous proteins transporters(SUTs)are ofsucrosein