j亚群禽白血病毒ah-j11株全基因组序列分析及其感染性克隆的构建.pdf

Anhui Agricultural University Dissertation for the Masterate Sequence analysis and construction of infectious clone of avian leucosis virus subgroup J AH-J11 strain Candidate: Wang Bei Supervisor: Wang Guijun Cooperant Supervirsor: Liu Guangqing Academic Degree appliedfor: Master of Agriculture Speciality: Preventative Veterinary Science Research field: Infectious diseases of domestic animal College: Animal Science and Technology college June, 2013 中文摘要 禽白血病 （Avian Leukosis ，AL ）是由C型禽反录病毒引起的禽类多种肿瘤性疾 病的统称。主要引起鸡的消瘦、生长发育不良和免疫抑制，此病在世界各国鸡群中广 泛流行，是危害养鸡业的重要传染病之一。由于该病毒能够通过水平传播和垂直传播 的两种方式扩散，现阶段主要通过淘汰携带病毒和患病鸡群，从而达到净化种群的目 的。 本研究根据GenBank上已发表的经典株HPRS-103株和SD07LK1株全基因序列， 设计并合成11对特异性引物，通过PCR方法将全基因组分为11个片段进行扩增，成功 扩增出ALV-J安徽分离株AH-J11 的全基因序列，并将其分别克隆至pMD18-T载体后进 行序列测定、拼接，并与GenBank上发表的不同来源的国内外流行毒株进行核苷酸及 其推导的氨基酸序列的同源性比较，分析遗传变异关系，绘制遗传进化树。序列分析 比对结果表明，AH-J11株的全长为7844nt ，由3个主要的结构基因gag 、pol 、env和两 端的LTR组成；gag 与pol 基因为相对保守区域，而env基因为病毒的主要变异区，并且 与HPRS-103株的全基因序列同源性最高，达到97.4%，遗传亲缘关系最近。研究结果 补充和丰富了ALV-J 的基因组信息数据，为了解ALV-J遗传变异关系及构建全基因感 染性克隆奠定了基础。 其次，采用融合 PCR 方法将全长 11 段序列融合至 4 段 J 亚群白血病病毒 AH-J11 株的前病毒 cDNA，PCR 产物经克隆后顺次连接至 pBluescript II SK+载体上，构建该 分离株的感染性克隆 （pBlALV-AH-J11 ），将 pBlALV-AH-J11 重组质粒纯化后转染鸡 胚成纤维细胞 （CEF ），拯救病毒，然后对拯救病毒 （rALV-J ）进行增殖培养，连续 传代 3 次。分别利用 RT-PCR 、Western-blot 和 IFA 方法，对拯救病毒进行鉴定。结果 证明，本研究构建了 AH-J11 株的全基因组感染性克隆，并拯救出了具有感染性的病 毒，为研究 J 亚群禽白血病病毒的致病机理和探讨新的防制措施等提供了良好的 ALV 的反向遗传操作技术平台。 最后，为构建以 J 亚型禽白血病病毒 （ALV-J ）的LTR 元件为启动子的真核表达 载体，将 ALV-J LTR 克隆至 pBluescript II SK(+)载体中，并在 5’LTR 和 3’LTR 之间分 别插入报告基因 （eGFP ）和新城疫病毒 （NDV ）的 NP