jsrv检测及srv转录起始调节基因ltr致瘤机制相关性研究.pdf

摘 要 绵羊肺腺瘤病(ovinepulmonary 病病毒(jaagsiektesheep 病原JSRV为B．反转录病毒，国际兽疫局(OIE)将该病列为B类传染病。 在国内，该病目前主要依靠常规病理学方法检测诊断，严重障碍了我国OPA 的快速诊断和防控，同时，对绵羊肺腺瘤病的发病机理尚有很多不清楚的 地方。 为了进一步研究JSRV的致病机制及建立快速诊断OPA的方法，本研 究在绵羊肺腺瘤病流行病学，病理学研究的基础上，以获得的3株抗 blot进行 JSRV．CA蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗，应用Western 肽探针扫描，以鉴定三株单抗识别的线性表位；并应用非竞争性ELISA法 测定三株单抗的功能性亲和常数，筛选合适的单抗，用于建立基于JSRV—CA 的血清学诊断法。 以阳性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本，比较阴性，阳性样本对 绵羊肺腺瘤病的阻断ELISA方法，并对该方法的特异性及临床应用作了检 LTR 方法。在700ng健康羊基因组DNA的背景下，梯度稀释阳性质粒pJSRV 为参照，对两种PCR方法的敏感性进行比较，并以建立的方法对临床病料 进行检测。 为研究JSRV转录起始／调节基因(LTR)与病毒致瘤机制的相关性， LTR作为研究材 需高纯度、高活力的肺泡n型上皮细胞及enJSRV／exJSRv 料。本研究采用IgG黏附法结合磁化树脂微粒法分离并纯化了山羊肺泡II 型上皮细胞，并应用碱性磷酸酶(AKP)结合核固红染色鉴定细胞的纯度， 应用台盼蓝检测细胞的活力。此外，克隆了JSRV的内外源性LTR，并对 U3 区的同源性及细胞转录因子结合位点的差异，并基于U3区的核苷酸序列， LTR系统遗传进化树。 用生物学软件Mega绘制了JSRV LTR的基础上，应用双 在获得了肺泡II型上皮细胞及enJSRV／exJSRV LTR与绵羊exJSRV 萤光素酶报告基因技术，比较了绵羊，山羊enJSRV LTR在不同细胞内的启动子活性。此外，分别缺失突变了LTR的Gfi·I、 C／EBP、HNF．3 LTR与突 B等三个转录因子结合位点，比较了绵羊exJSIW 变后exJSRV LTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内启动子活性的差异。， 实验结果为：(1)本研究建立的ELISA法以阻断率为37％作为阴性与 阳性判断的临界点，可以明确区分感染JSRV的阳性病料与健康阴性对照。 所建立的PCR检测方法中，套式法的敏感性是一步法的10倍以上，可检 测出样本中1～l0拷贝的JSRV，同步检测结果表明，以上的血清学和PCR 检测方法与临床病理组织学诊断的结果高度一致。(2)本研究分离纯化的肺 泡Ⅱ型上皮细胞纯度为90％以上(AKP染色法)，活细胞为95％以上(台 盼蓝染色法)。(3)将本研究克隆测序的enJSRV／exJSRV 发表的其它JSRVLTR序列进行了系统遗传进化树分析，表明本研究克隆 的enJSRV／exJSRVLTR分支明显，且现有的enJSRv／exJSRVLTR在病毒与 宿主共进化的过程中分别演化出2个不同的分支。本研究克隆的我国内蒙 古地区JSRV流行株与欧美毒株有较近的亲缘关系。(4)双荧光素酶分析试 验表明，除肺泡Ⅱ型上皮细胞外，enJSRV／exJSRVLTR在各细胞内的启动 子活性差异较小，而exJSRVLTR在肺泡Ⅱ型上皮细胞内相对活性为其他 细胞内相对活性的24．230倍。分别缺失突变C／EBP，HNF．3B转录因子结 合位点的绵