i型鸭肝炎病毒国流行株生物学特性相关研究.pdf

摘要 鸭肝炎病毒(Duck virus，DHV)是引起鸭病毒性肝炎(Duckviral hepatitis 病原，该病毒可分为3个血清型， 养鸭业的重要病原，造成了巨大的经济损失。 包括山东、广东、北京、福建、江苏和云南等省市110多个养殖场鸭的肝脏病料，通过接种9．11 日龄SPF鸭胚，接种后72h内收集尿囊液并盲传3代以上，观察接种胚体的病理变化，结合基因 代鸭胚就会出现明显病变，表现为全身出血、发育受阻、胚死亡等病理变化，且鸭胚尿囊液对鸡 外周血红细胞没有凝集活性，表明尿囊液中不含能够凝集鸡血红细胞的禽正粘病毒、副粘病毒等。 为迸一步了解中国DHV-1的分子特征、基因遗传演化特征以及不同基因型病毒的分布，本 研究通过对GenBank上发表的其他毒株基因组序列进行比对，在保守区设计6对引物，同时应用 因此本研究首先利用全基因组遗传发育分析将分离到的16株病毒与小RNA病毒科其它7个病毒 属的14株病毒进行比较，发现本研究分离到的DHV-1与其他小RNA病毒具有较远的遗传关系， 株DHV-1参考毒株进行了系统发育进化比较，表明DHV-1可分为A、B和C3个基因型，与已 报道结果一致。本研究分离到的16个毒株中，13个属于基因A型，另外3个为基因C型。本研 病毒序列同源性在90％以上，而不同基因型病毒序列同源性不足80％。 雏鸭进行攻毒试验。结果显示该毒株对SPF雏鸭的致死率为30％，攻毒24h后部分雏鸭开始死亡， 死亡鸭的病变部位主要集中在肝脏，表现为肝脏肿大、出血及坏死等；同时伴有脾脏和胆囊肿大 较好的重复性，可以作为检测抗原。以此作为包被抗原，建立ELISA抗体检测方法，发现 阳性。 为了进行DHV-1的鸡胚适应，以便为疫苗研制等奠定基础，本研究通过9-11日龄鸡胚系列 鸡胚典型病变，利用该鸡胚传代适应毒株接种雏鸭，发现其对SPF雏鸭不产生致病作用。继续传 至第40代(P40)进行雏鸭的接种和亲本强毒的攻毒试验，发现该病毒不但不引起雏鸭发病，而且 能对亲本强毒的攻击提供了良好的保护性。表明该毒株具有疫苗研制的良好性能。为了进一步说 因组进行比较分析，结果显示，病毒在适应鸡胚过程中，病毒基因组发生了明显变化，主要表现 为核苷酸的突变及其导致的氨基酸的替代，突变的主要位点位于L、VPl、2C和3D蛋白。 在以上研究基础上，本研究以弱毒株Du／CH／LBJ／090809P40基因组为基础，进行基因点突 变的分子修饰，构建了eDNA全长的感染性分子克隆，通过体外转染BHK细胞后，将细胞液在 得到重组病毒粒子。这将为DHV-1的遗传进化、致病机理、基因功能等相关研究奠定基础。 关键词： I型鸭肝炎病毒； 基因组； 致病性；鸡胚传代；感染性克隆 IV Abstract Duckviral isall diseaseof hepatitis(DVh9acute，highlycontagious，viral young maincharacterizationofDVHis of DVHisduck hepatitis．Theagent hepatitis distinct havebeen as and serotypes detected，termedDHV-1，DHV-2DHV．3．Nocross．reactiveare detected thethree isthemost andsevereone．Itisofeconomic among serotypes．DHV-1important inall the areasof world． importanceduck-raising SixteenDHV-lviruseswereisolatedf