上海地区猪链球2型的流行病学调查及其pgk基因缺失株的构建.pdf

摘 要 猪链球菌病是由猪链球菌引起的一种重要人兽共患病，尤其是猪链球菌2 型，不 仅对猪的致病性强，而目还可感染特定的人群，甚至致死，给养猪业和人类公共卫生 造成巨大影响。但迄今为止，其致病机制尚不十分明确。因此，本研究在流行病学调 查和耐药性分析的基础上，拟通过基因敲除技术构建基因缺失株，为进一步研究猪链 球菌的致病机制奠定基础。本文主要开展了下列研究： 研究采集临床症状疑似猪链球菌2 型感染猪的全血、内脏器官及粪便，进行细菌 的分离纯化，运用双重PCR 法鉴定，根据检测结果选取所有毒力因子阳性的2 型菌株， 应用SPF 巴马小型猪作为动物模型进行致病性实验，筛选出强毒株，为后续实验提供 可用的强毒株。最后用纸片扩散法对临床分离到的猪链球菌2 型菌株测定其耐药性。 本实验采用同源重组的原理，将PGK 基因上下游各500 bp 和800 bp 左右的两侧 序列以及Cm 抗性基因分别克隆到质粒载体PUCl8 上，两侧序列作为同源臂。用EcoR I/ Sph I 酶切pUCl8-PsCmPa 和穿梭载体pSET4s，回收连接片段，将回收所得的片段 定向插入到经同样的内切酶双酶切处理过的温敏型质粒 pSET4s，将连接产物转化大 肠杆菌DH5a，提取质粒电转化到SH08 感受态细胞中，在经过28℃复苏和37℃质粒 丢失后，利用PCR 法和抗性筛选基因缺失株。 结果显示在116份样品中检测到31 株猪链球菌2 型，对9 种药物耐药率为AM： 80%、GM：68%、CHL：84%、SXT：52%、CIP：55%、ERY：22.6%、TCY：38.7%、STR： 6.5%、PEN：16.1%。试验结果表明分离的31 株2 型猪源性链球菌，均为多重耐药株， 且AM 的耐药性最为严重。同时筛选到了强毒株SH08，在最佳电转条件：电压2.25KV， 电容25 μF，脉冲电阻500 Ω下成功构建了PGK 基因缺失株。 综上所述，猪链球菌2 型病仍是威胁上海地区养猪业的主要传染病之一，且病原 较为复杂，耐药性的产生也给药物治疗带来越来越多的困难，尤其是对临床首选药 AM、GM 及 PEN 也产生不同程度耐药性。同时本试验利用同源重组原理在国内外首次 构建了PGK 基因缺失株，为研究猪链球菌的致病机理，并进行有效的防治猪链球菌病 减少耐药性的发生奠定了基础。 关键词：链球菌2 型；耐药性；基因敲除 Epidemiological Survey of SS2 in the Shanghai Area and the Construction of the PGK Gene Deletion Strains Abstract Streptococcus suis disease is caused by Streptococcus suis.It is an important zoonotic disease,especially streptococcus suis type 2,not only the most pathogenic in pigs and specific populations and death,to human pubic health and pig industy have a tremendous impact. But so far, the pathogenesis is not very clear. Therefore, this study on the basis of the epidemiological investigation and analysis of drug resistance, to be through gene knock addition to the technical building gene deletion strains, and to lay the foundation for further study the pathogenic mechanism of the Streptococcus suis. In this paper carried