动物布鲁氏菌快检测方法的研究.pdf

摘 要 布鲁氏菌病是一种危害严重的人兽共患病，在世界范围内广泛流行。我国布鲁氏 菌病主要的诊断方法为细菌分离培养和血清学检测（虎红平板凝集和试管凝集试 验），但满足不了快速检测的要求。本论文开展布鲁氏菌快速检测方法的研究，从血 清学抗体筛查→阳性样品的病原学检测→病原的分型鉴定，建立系列的检测方法， 为布鲁氏菌病净化检疫，提供快速有效地手段。 1．建立胶体金试纸检测方法，适用于现场检测。根据双抗原夹心法测抗体的原 理，用葡萄球菌蛋白A 和布鲁氏菌重组蛋白bp26 抗原建立检测布鲁氏菌抗体的胶体 金免疫层析试纸条。特异性试验结果表明，阳性和阴性血清检测结果正确，说明该 方法特异性较好。试纸条保质期为4℃保存6 个月。 2．建立荧光定量PCR 检测方法，适用于检测病原。以布鲁氏菌属OMP10 保守片 段为靶基因，设计特异性引物和Taqman 荧光探针。将OMP10 基因片段克隆到pMD19-T 载体，提取质粒，制备标准品及标准曲线。特异性分析结果显示，对照菌株均未出 现荧光信号，说明该方法特异性较好；灵敏性分析表明，该方法最低检出数量级为 -4 为 10 ng/ μL；标准质粒的稳定性试验结果表明，在不同检测时间、不同反应管之 间的域值的变化很小，组内组间变异系数均小于2%。 3.建立布鲁氏菌分型多重PCR 方法，适用于病原进行分型。根据布鲁氏菌基因 组多拷贝插入元件IS 及其下游多态位点，设计布鲁氏菌牛、羊、猪种分型引物， 711 优化PCR 反应体系和条件，建立布鲁氏菌分型的多重PCR 方法。特异性分析结果显 示，对照菌株未见扩增，说明该方法特异性较好。灵敏性分析表明，其最低检出数 -2 量级为10 ng/ μL。 关键词：布鲁氏菌；胶体金试纸条；荧光定量PCR ；多重PCR ；检测方法建立 Study on the Rapid Detection Methods of Animal Brucella Abstract Brucellosis is one kind of amphixenosis, which is severely impaired in the world. The detection methods in my Country are bacteriology and serology (RBT and SAT). But, these methods have many drawbacks. It is necessary to establish new methods to improve detection level. This study established three methods to lay a foundation for Brucellosis control. To meet the demand of the quarantine purification of brucellosis, the papers study on the rapid detection method of brucellosis, the serological typing identification of pathogen detection antibody screening → positive samples → pathogens. 1. Established colloidal gold immunochromatography assay(GICA) for the field detection brucella.According to double antigen sandwich detection antibody