日本血吸虫抱雌蛋白相互作用分子的鉴定及两个相关蛋白的研究.pdf

摘要 血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患病。目前可以通过药物对感染血吸虫病的 个体进行治疗，但是药物治疗不能很好地解决重复感染的问题，也不能有效的预防血吸虫病的 发生，所以血吸虫病疫苗的研发显得尤为重要。在血吸虫生长发育过程中雌雄虫合抱尤为关键， 血吸虫抱雌沟蛋白是一种可在雌雄虫合抱过程中进行传递并影响雌雄虫合抱的物质。因此，血 吸虫抱雌沟蛋白及与其相互作用蛋白的研究对血吸虫生长发育机制的探索及新疫苗的开发具有 重要意义。 本论文研究工作首先分析了日本血吸虫抱雌沟蛋白功能，然后在本实验室前期利用酵母双 杂交技术筛选出多个与日本血吸虫抱雌沟蛋白相互作用阳性克隆的基础上，通过回复杂交实验 验证了部分克隆与抱雌沟蛋白间的相互作用，并从中挑选两个基因进行了进一步的研究。论文 具体研究工作如下： 一、抱雌沟蛋白功能分析及其相互作用蛋白的鉴定 利用RNAi和表达谱芯片技术对抱雌沟蛋白功能进行分析，结果显示抱雌沟蛋白可能是一 种细胞粘附蛋白，对血吸虫的生长发育及代谢等生物学进程产生重要影响。另外，本实验室前 期研究成功构建了18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA预杂交文库，并利用该技术筛选到与 日本血吸虫抱雌沟蛋白相互作用的383个阳性克隆，对序列分析整合后得到45条不同的基冈序 列。为了排除假阳性，对筛选到的基因进行了酵母体系相互作用验证，结果得到16个与抱雌沟 蛋白相互作用的基因，并排除了4个假阳性克隆，相互作用分子中12个为已在GenBank登陆 的基因，另外4个为未知基因。 二、SjOALE基因的研究 RT-PCR和Westernblot考查了该基因在 首次克隆并表达了SjCALE基因，利用real-time 日本血吸虫不同时期的表达情况，结果显示该基因在日本血吸虫的各个时期均有表达，23d成 虫体内表达水平最高。免疫组化实验表明该蛋白主要分布于日本血吸虫体被，少量存在于虫体 减虫率和减卵率分别为34％和49％，每只雌虫对肝脏虫卵负荷贡献率降低63％，并且产生了高 数值逐渐降低，说明rSjGALE免疫小鼠后引起Thl型免疫反应。进一步的细胞因子实验分析发 显著升高，儿-4的水平没有明显变化，进一步证实rSjCALF．介导了Thl保护性免疫反应。 三、日本血吸虫新基因Si34．9的研究 Sj34．9是经验证与日本血吸虫抱雌沟蛋白具有相互作用的分子，且该分子在之前的：L=作中 从未被报道。为深入研究该分子的生物学功能，本研究利用酵母双杂交所得该阳性克隆的已知 部分序列，利用RACE技术扩增得到其全长cDNA．其完整cDNA序列1514bp，含有完整的 ORF966 kDa，等电点为9．38。经查询表明该基冈 bp，编码321个氨基酸，理论分子量为34．9 利用Real-timePCR分析了sj34．9基因在血吸虫不同时期的表达情况，结果显示该基因在血吸 虫各个时期几乎稳定表达，且雌虫体内该基因的转录水平高于雄虫。利用rsj34．9蛋白免疫小鼠 I 后攻击感染日本血吸虫尾蚴，通过虫卵数的统计考查该重组蛋白的免疫保护作用，结果发现 内的表达进行了干扰，利用血吸虫的寡聚核苷酸表达谱芯片分析了Sj34．9基因表达沉默后血吸 虫基因的表达情况。结果显示，RNAi组与对照组相比，显著差异表达的基因共378个，其中 上调基因202个，下调基因176个；通路分析显示，差异基因主要与物质代谢，信号转导及信 号分子间相互作用有关；基因本体论(Go)分类结果显示．多数基因与分子间结合，膜的构成， 细胞过程和机体的生长发育及代谢相关。因而推测Sj34．9基因可能对日本血吸虫的形成、生长、 发育、调节、代谢等有重要作用。 关键词：日本血吸虫，抱雌沟蛋白，酵母双杂交，UDP-葡萄褚表异构酶，Sj34．9基因，基因芯 片 n Abstract arc isall health of