检测a群猪轮状毒胶体金免疫层析试纸条的制备.pdfVIP

摘要 摘 要 猪轮状病毒感染在我国和世界各养猪国家普遍存在。快速准确地疾病监测是防治该病的 前提条件，虽然轮状病毒检测有多种方法，但适用于现场对病原作出快速检测的方法还很有 限，基于此本研究运用胶体金免疫层析技术，建立一种快速、简便、灵敏的检测A群猪轮状 病毒的方法。 将纯化的重组PRVVP6蛋白免疫兔子，制备得到抗VP6蛋白的多克隆抗血清；用抗PRV VP6蛋白腹水单抗。采 VP6蛋白杂交瘤细胞株C5D10注射BALB／C小鼠，制备得到抗PRV 取辛酸一硫酸铵盐析法和蛋白A(及G)亲和层析法对多克隆抗血清和腹水单抗进行两步纯 示提纯后的抗体没有杂带，主要为丫球蛋白，纯化后的单抗与多抗同VP6蛋白ELISA效价 分别为lO-5和1：1200；采用柠檬酸三钠还原法制备20nm的胶体金颗粒，胶体金标记纯化 1．t 后的单抗，最佳标记量和最适pH值的测定结果分别为60g／ml和PH8．5，低温超速离心法 纯化标记好的金标单抗；纯化后的胶体金标记抗体作1：2．5稀释，吸附于玻璃纤维。用纯化后 的多抗在硝酸纤维素膜(HFl35)上划线作为检测线，最适划线浓度为O．8mg／ml：用羊抗鼠IgG 在硝酸纤维素膜(HFl35)上划线作为质控线，最适划线浓度为0．5mg／ml。检测试纸条对PRV 培养液和未接种病毒的细胞对照液作为己知阳性和阴性进行实验，检测时间约10min，病毒 培养液在检测线和质控线出现两条明显的红色条带，检验结果为阳性，而细胞对照液只在质 控线上出现红色条带，在检测线未出现，检验结果呈阴性，与预期设计的结果相一致。对试 纸条进行了敏感性、重复性、特异性实验。结果显示：试纸条检出病毒培养液(TCID50是 0．1ml 10咱‘25)最低限度为1：32稀释；不同批次试纸条重复检测，结果无明显差异；试纸条 不与猪传染性胃肠炎病毒、流行性腹泻病毒相关腹泻病毒发生反应，表明所制备的试纸条具 有一定的敏感性、重复性和特异性。本研究所建立的检测抗原的胶体金免疫层析试纸条，为 猪轮状病毒病的快速诊断奠定了基础。 关键词：猪轮状病毒；胶体金；免疫层析；试纸条 Abstract ofGold Preparation Kitfor APorcineRotavirus Group Abstract and the countrieswhere Infectionof rotavirus inChinaall other pigs porcine spreadwidely are andexactsurveillanceiSthe for andcureofthe raised．Quick premiseprevention fitfor thereare methodstodetect methodsthatare disease．Thoughmany porcinerotavirus，the spot fast ofPRVarefew．Onaccountof areusedto diagnosis this，gold·immunochromotographyassay establisha andsensitivemethodtodetectthe rotavirusofAgroup．