嗜热芽孢杆菌h08及其耐高温中性蛋白酶的性质研究.pdf

摘 要 蛋白酶是目前世界上应用最广泛的一类酶制剂，占全世界工业用酶总量的 65％左右．高温蛋白酶具有热稳定性好、耐有机溶剂和表面活性剂、半衰期长等 特点，己广泛用于洗涤剂，皮革、食品、啤酒酿造、丝绸、医药等领域．本研究 从火焰山土样中分离得到一株嗜热菌，经初步鉴定为芽孢杆菌属成员．经诱变大 大提高了耐高温中性蛋白酶的产量；并对产酶条件优化、发酵液中蛋白酶的提取、 蛋白酶的分离纯化与生化特性及其在洗涤剂、氧化剂、有机溶剂等中的稳定性进 行了较系统地研究。 (1)从新疆火焰山地区土样中分离及筛选到一株较高产耐高温中性蛋白酶 的菌株x4，经紫外线、亚硝基胍和C02激光诱变育种大大提高了其产酶量。菌 株x4经形态学及生理生化初步鉴定为芽孢杆菌属成员，命名为Bacillus sp．X4． 得出了此菌原生质体制备的优化条件：对数生长期(10h)的菌龄，培养6h后加 入0．5 U／mL青霉素，溶菌酶浓度0．8％，酶解温度3012，酶解pH7．0，酶解时间 KCI．以Bacillus 5h，渗稳剂0．7mol／L sp．X4为出发菌株，分别经原生质体紫外 线诱变、亚硝基胍诱变和c02激光诱变育种，得到一株耐高温中性蛋白酶产量 有较大提高的菌株Bacillus U／mL，比出发菌株高温中 sp．HS08，其产量为3132．1 性蛋白酶产量提高4．51倍。连续传代试验表明该突变菌株具有良好的遗传稳定 性，无明显回复突变． (2)优化了Bacillus sp．Hsos的培养条件．复合碳氮源(玉米淀粉、大豆粕 和酵母膏)联合葡萄糖有利于产酶，在培养基中添加0．29／L CaCh、0．29／LMgS04 和0．2g／LTween．80有利于耐高温蛋白酶的产生．经响应面优化的培养基为玉米 淀粉19．8 g／L，酵母膏3．9 g／L，大豆粕9．7g／L，葡萄糖3．6 g／L，在该培养基中酶活 U／mL-与确证实验值(6804 力预测值6754 U／mL)相符。优化的发酵工艺为：培 养温度4612、摇瓶转速200r／min、种子菌种龄16 h、接种量5％、培养基初始pH8．0、 培养基装瓶量100mL／500mL瓶、培养时间60h时产酶量达到最大值。 (3)采用AOT／异辛烷反胶团初步分离纯化Bacillus sp．HS08发酵液中耐高 温中性蛋白酶是可行的。在萃取时间5 NaCl、水相与有机相体积比为1：1时，转移到有机相中蛋白酶活力达到最高值； Il KCl时能有效地将蛋白酶反萃取到水相中，蛋 反萃取时，水相pH8．0、0．8mol／L 白酶活力回收率达75％以上． (4)得出了该耐高温蛋白酶的酶学性质与稳定性．该蛋白酶的相对分子量 70C时的温度半衰期分别为406，104、80和25min；PMSF能显著抑制该蛋白 SDS、Tween-80、 酶活性，是一种Zn2+激活的丝氨酸属蛋白酶；对表面活性jif!I Triton X-100和氧化剂H202、NaB03较稳定；在几种商品洗涤剂中保持较强的活 性；在正十六烷、正十二烷、正癸烷、异辛烷等有机溶剂中很稳定；在丙酮、乙 醇、DMF和DMSO等极性有机溶剂中也能保持一定的稳定性，特别是在DMSO 中还能保持较强的蛋白酶活性，在有机体系的多肽合成中具有较好的应用前景． 关键词：芽孢杆菌