嗜线虫致病杆菌虫蛋白的分离纯化及杀虫蛋白基因克隆.pdfVIP

摘要 虫互惠共生。二者联合可以侵染并快速杀死多种昆虫。通常共生菌依靠线虫将其携 带进入寄主昆虫体内并释放到昆虫体腔中，共生菌在昆虫血腔内大量繁殖并产生 杀虫毒素，导致寄主昆虫迅速死亡(约48h之内)。同时共生菌产生的抗生素抑制 杂菌生长，为线虫生长、发育和繁殖提供理想的环境和合适的营养。昆虫病原线虫 一共生菌复合体对昆虫其有的强致病力，共生菌在其中起着关键性作用。已有的 研究表明许多共生菌不仅能产生血腔毒素，同时还能产生杀虫谱广、杀虫活性高 的胃毒素。因此分离筛选高毒力的共生菌菌株、对其杀虫毒素及其杀虫基因进行 深入研究，有助于发掘新的杀虫蛋白及杀虫基因，有可能为改变当前害虫防治和 转基因抗虫植物的培育中杀虫蛋白或杀虫基因匮乏的局面开辟一条新的途径。 本研究利用大蜡螟和黄粉虫土壤诱集法，从河北省各地的719份土样中的28份 诱集到了昆虫病原线虫，有线虫率为3．89％。经初步鉴定25个为异小杆属线虫 ％。通过取被感染大蜡螟血淋巴涂平板的方法，分别从这28个线虫品系中分离出28 个共生菌菌株。 对从河北省分离的28个菌株和4个本窒保存的菌株的部分16SrDNA序列进 行PcR扩增和测序，与共生菌已知种的同源序列进行比较分析，构建了系统进化 树，初步确定了这32个共生菌的分类地位。这些菌株明显分成嗜线虫致病杆菌和 coli 和503的位置(E Photorhabc／us为A和C。 从河北省分离到的发光光杆菌大部分与P luminescens 簇。其中HB89和HBgy相似性达100％，二者与P 是Pluminescens中的新亚种或新种。GZl39与P 该种的一个品系。D1菌株与已知的Pluminescens 同一亚种。HB310和HBml均为Z 中的一个新种。 HB310菌株的I型菌与II型菌部分16S 菌株的I型菌与II型菌的形态特点、生理生化指标测定及杀虫活性存在较大的差异。 I型菌的胃毒活性和血腔活性远远高于II型菌。II型菌的蛋白组份发生了很大的变化， I型菌和II型菌的基因组DNA中都扩增出同样大小的毒素基因片段。 HB3 10、Silo、HBml、A24和户luminesense 丑nematophila 等多株共生菌对棉铃虫和小菜蛾等有较高的口服胃毒活性，其中X 品系的杀虫活性均高于其它种类的菌株。不同属、种及同种不同品系的共生菌对同种 昆虫的胃毒活性差别很大，同一菌株对不同昆虫的毒力差别也较大。小菜蛾对共生菌 是比较敏感的，Xnematophila HB202、D1、 h均可100％杀死小菜蛾2龄幼虫。 HBgy等6个菌株的发酵液在72 对HB310菌株杀虫活性的深入研究表明，该菌的杀虫谱较广，对鳞翅目和鞘翅 目的10种昆虫都有胃毒活性，特别是小菜蛾、菜粉蝶、云斑粉蝶和马铃薯二十八星 h的致死率达到100％。对 瓢虫等幼虫有很强的胃毒活性，其发酵液对四种幼虫在72 棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟等幼虫的生长有很强的抑制作用。HB310菌株在对数生 长初期已开始产生杀虫毒素，在对数生长中后期(15h)其杀虫活性己达到最高。 HB310菌株发酵液中的细胞和胞外上清蛋白提取物中都含有较强的血腔注射杀 别含有3～4个多肽，而血腔毒素只看到一条带，可能是一种单体蛋白。纯化的血腔 min； 毒素对5龄大蜡螟幼虫血腔注射LD50为181．5ng／头。血腔毒素耐70℃处理10 胃毒素耐50℃处理10min，对其杀虫活性无影响。血腔毒素能够破坏血细胞成碎片。 构建了盖nematophila HB310中筛选到对棉铃虫初孵幼虫有口服胃毒活性的2个克隆： nematophila 克隆对棉铃虫幼虫的口服毒力LC50为9．5x1010cells／mL。 根据GenBank中丑nematophila