甜菜夜蛾（spdoptera exigua）几丁质合成酶a基因的克隆、时空表达及功能的初步研究.pdf

甜菜夜蛾(Spodopteraexigua)几丁质合成酶A基因 的克隆、时空表达及功能的初步研究 专 业：农业昆虫与害虫防治 博士生：陈晓菲 指导老师：张文庆教授 摘 要 几丁质是自然界中储存量仅次于纤维素的第二大天然多糖，广泛存在于真 菌、昆虫和甲壳类动物之中。几丁质是昆虫表皮(外骨骼)的主要成分，也是许 多昆虫肠道表皮的重要成分，而几丁质合成酶(CHS)是几丁质生物合成过程中 非常重要的酶。但是在相当长一段时间，关于CHS的研究工作主要集中在真菌 领域，直到2000年，才有第一个昆虫的CHS被克隆出来。迄今为止，昆虫几丁 质合成酶的研究仍不多见，但是随着研究的深入，人们更加确认CHS对于昆虫 生长发育的重要性是不容忽视的。 本文在已经克隆得到甜菜夜蛾几丁质合成酶(SeCHS)cDNA的基础上，进一 步得到了其基因组DNA全长，约15kb，包含21个外显子和20个内含子。通过 分析发现其存在交替外显子结构，证明此cDNA序列为A类的几丁质合成酶基 blot分析表明，CHSA在甜菜夜蛾幼虫的表皮组织、气 因(SeCHS舢。Northern 管有大量表达，说明SeCHSA对于表皮和气管几丁质的合成发挥了重要作用． 但是在脂肪体，马氏管中则检测不到其表达。分析还表明尽管＆CHSA基因在 甜菜夜蛾生长发育的过程中都有表达，但是在各龄开始和结束时以及蛹期表达量 要明显高于其他时期，而此时正是甜菜夜蛾新表皮形成的重要时期，＆CHSA对 表皮形成的重要性再次得到验证，并且暗示此基因的表达可能受到某些因子的调 发现SeCHSA蛋白在表皮组织和气管壁中有大量堆积，再次证明此基因参与了 表皮和气管几丁质的形成． 为进一步研究此基因的功能及其对昆虫生长发育的影响，我们采用了RNAi 和siRNA片段，发现这两种RNA均可以在细胞中引起目的基因的沉默。之后我 们用体外注射的方法在甜菜夜蛾5龄幼虫体内实现了目的基因的干扰。并且发 达受到抑制之后，昆虫的正常生长发育即被破坏，产生发育畸形死亡的现象，注 ％)的对照组相比，有显著差异。表皮电镜切片显示，与正常表皮组织相比，注 射siRNA组的表皮的几丁质不再呈现规则的片层结构，而是变得杂乱无章；气 管组织的几丁质染色显示，注射siRNA组的气管在伸长过程中出现畸形，且几 丁质含量有所降低。这些结果说明，SeCHSA对甜菜夜蛾的生长发育有着至关重 要的作用，基因的不表达可直接导致甜菜夜蛾的发育畸形甚至死亡。 关键词： 几丁质合成酶基因 交替外显子表达定位RNAi功能甜菜夜蛾 H Molecular and cloning，expressionpatternspreliminary ofchitin Aof studiesonthefunction synthasegene InsectsandPestControl Specialty：Agricultural NIEffletC既NXiaofei Supervisor：Prof．ZHANG Wenqing Abstract Chitinis a linear ofb-(1-4)·linked polymer it structuralrolein cuticlesof 【b-(1-4)-linkedGIcNAc]，andplays the arthropod． anim