蝶蛹金小蜂卵黄生与卵子发生的生理与分子基础.pdf

致 谢 本论文是在导师叶恭银教授悉心指导和关怀下完成的。三年来，叶老师严谨的治学态 度，渊博的学识造诣，睿智的科学思考，知难而进的科研追求，忘我的工作作风，时刻激 励和鞭策着我，是我战胜种种困难的巨大动力，使我终身受益。在平时生活中，也得到了 叶老师和师母无微不至的关怀和大力的帮助。本课题组的胡萃先生和姚洪渭副教授，在平 时学习、工作和生活上给予极大的帮助，在此表示感谢! 本论文的部分研究工作是在浙江大学生物技术所单克隆实验室完成。在实验过程中， 得到该实验室程正贤老师的热心指导和帮助，尤其是在实验的思路和方法改进上给予我较 大的启示。蜕皮激素的测定是在中国科学院植物生理研究所完成，该所的曹梅讯教授和蒋 容静副教授在实验中给予我极大的帮助。冷冻切片的制备和荧光观察是在浙江省农业科学 院植物保护与微生物研究所分子生物学实验室完成的，该实验室的俞晓平研究员给予极大 的帮助和支持，在此向俞老师表示衷心的感谢! 实验过程中．本研究所程家安教授、刘树生教授、陈学新教授、张传溪教授、沈志成 教授、施祖华教授、徐志宏教授、祝增荣研究员、莫建初教授，唐启义研究员、娄永根教 授、蒋明星教授、余虹副教授、刘银泉副教授、鲍艳原副教授和马云高级实验师等在实验 方面给予了很多的帮助和便利，感谢各位老师的真诚帮助! 浙江大学昆虫学研究所昆虫生理生化与分子生物学实验室是一个积极向上、团结友爱、 生机勃勃、学术气氛浓厚的集体。在三年的学习和生活中，得到了本课题组的师兄、师姐、 师弟和师妹的大力帮助。他们是张忠、陈茂、李凯、吴国星、黄诚华、李芳芳等I尊士，姚 鹏程、韦国栋、王慧、陈亮，卢新民、谭红、裒志东、高熹等硕士，博士生石宇、张倩倩、 吴玛莉、朱家颖、方琦、慎小晶、田俊策、王欢，硕士生董卉、张光林、郭建洋、高秀云、 韩成香，吴珏靖，本科生黄耀亮、陈雁、高一波、胡金飞，特此表示衷心的感谢。 此外，我要特别感谢我的家人在找求学的路上给予的理解和大力支持，使我能够安心 完成学业。 最后。谨向参加论文评阅及答辩委员会的专家、教授们致以崇高的敬意! 董胜张 2007年6月于浙江大学华家池校区 中文摘要 本论文选择了菜粉蝶Pieris rapae蛹期的优势内寄生蜂一蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum作为研究对象，在制各该蜂Ⅵ单克隆抗体和解析VgeDNA序列的基础上，分别 从生理生化、细胞和分子水平对其卵黄发生、卵子发生和生殖调控的机制进行了系统的研 究。主要结果概括如下： 1．vt的纯化与生化特性 非变性PAGE电泳结果表明，在雌蜂的血淋巴中和成熟卵内存在一条雌性特异蛋白条 带，而在雄蜂的血淋巴中未发现相对应的条带，该蛋白条带能被脂蛋白、糖蛋白和磷酸化 蛋白特异性染色。因此推测此雌性特异条带为该蜂的vt，而雌蜂血淋巴中对应的为Vg， kDa的两个亚基组成。通过P-100凝胶过滤层析和pl阴离子交换层析的方法，从卵内可 溶性蛋白中纯化出vt。双向电泳分析表明，成熟卵内可溶性蛋白约由1lg个点组成，等电 点主要集中于5～8．5之间，分子量主要集中于130～250kDa和25～50kDa两个范围，Vt 约占到总蛋白的50～70％，Vt两个亚基的等电点均约为8．2。 2．vt单克隆抗体的制备与应用方法的建立 采用杂交瘤细胞技术。分别制备得4株能稳定分泌抗蝶蛹金小蜂vt的单克隆抗体 (mAb)，即PpVtmAbl、PpVtmAb2、PpVtmAb3和PpVtmAb4。4株单抗分别制取了腹 mAbl的腹水进行了纯化。4株单抗免 水，其腹水上清的效价均达到105以上，且对PpVt 疫球蛋白的重链和轻链的亚类均为19Gl和K类型。 不同组织的Western免疫印迹结果表明，rnAb不仅特异性识别卵巢内vt，而且识别 雌蜂血淋巴中Vg，但与雄蜂血淋巴无反应，可以用于veNt的定性或定量检测。通过对直 了微量检测蝶蛹金小蜂体内vgrvt的最适ELISA方法，即异源双夹心ELISA法。该方法 可用于单头雌蜂体内vg／vt的定量检测，其检测灵敏度约为20