用多种方法提取性排水沉积物中微生物dna.pdfVIP

摘要 摘要 通过DNA序列认识参与催化酸性排水(AMD)污染形成的微生物的前提条 件是寻找到适于样品的DNA提取方法。江西德兴铜矿规模巨大，开矿历史久远， 对周围大片区域造成了严重污染。本研究以该矿的三个不同特征样品(C，z和 察了几种不同的样品预洗涤、提取和纯化方法对DNA提取物质量的影响，以建 立适于该矿区及类似矿区的微生物DNA提取方法。质量评价包括提取量，片段 大小，纯度，16S rDNA基因扩增效果，以及ISR(IntergenicSpacerRegion)基 因多样性。 样品预洗涤采用四种溶液：P(Na2HP04和Nail2P04：0．1M)，E(Na2EDTA： O．5 M；NaCl·1．5M； 0．1 前两种提取方法。 M NaCl，0．01 M MIris—HCI和0．001Na2EDTA；0．1 mg／ml蛋白酶K在50℃作用1小 EnvironMicrobiol 时)，高盐蛋白酶K法(Zhou法，Appl 62(2)：316．322，不含TX．100 的M1法提取液，0．08 SoilMicrobe mg／ml蛋白酶K在37*(2作用0．5d,时)，以及ZR Research DNAKitTM法(Kit法，ZYMO Corp．)。Ml和M2法均序列经过溶菌酶、 振荡处理(蛋白酶K处理后)。 粗DNA(经有机溶剂处理)的纯化采用六种凝胶电泳法。前四种方法均采 用普通凝胶，但用如下不同的方法从凝胶中回收DNA：有机溶剂法，30％PEG 溶液槽法，低熔点凝胶槽法，以及含2％PVP的低熔点凝胶槽法(该法中的普通 凝胶也含2％PvP)。后两种方法在采用低熔点凝胶电泳后不经回收(直接用于基 因扩增)或用试剂盒回收。 研究发现：虽然M1和M2法均可从有机碳含量较低的C和z样品中提取到 DNA，但是M2法需经预洗涤：而从有机质含量较高的Y样品中，只有经预洗涤 摘要 在凝胶上显现。 研究还发现：提取到的DNA在经普通凝胶电泳和低熔点凝胶槽回收的纯化 过程后，通常可用于16SrDNA和ISR基因的PCR扩增；虽然Kit法的提取物不能 在凝胶上显现，但可成功用于如上两个基因(C样品)和只有16SrDNA基因(Z 样品)的扩增。 不同方法所提取到的DNA片段大小相差不大，均在23．1kb左右；DNA提取 量为1．8}tg／g至14p眺，但通常小于10pg／g：提取量随方法而不同，M1法从C样 品中提取到的DNA总是多于M2法，但这两种方法从Z和Y样品中的提取量的比较 并不显示一致趋势，取决于预洗涤条件；此外，P和TEN2+TX-100预洗涤的提取 量总是高于E预洗涤。 提取到的DNA纯度随样品有机碳含量增高而下降。高盐预洗涤液 物的纯度下降，特别是有机碳含量高的Y样品。考虑PCR扩增的可行性，纯化结 果的稳定性，以及试验操作的简易性，通过普通凝胶电泳及低熔点凝胶槽回收 被确定为本实验样品的最佳纯化方法。 不同提取方法的ISR电泳图谱显示出不同的扩增带型(数量，位置和强度)。 对于C样品，经TEN2+TX．100预洗涤的M2法所得到的带数最多。对于Z和Y样品， 差别则主要表现在带的强度上。 以上结果表明，为了从AMD沉积物样品中得到高质量的DNA提取物，应比 较多种提取方法。对于本研究的AMD沉积物来说，预洗涤是必要的，特别是有 机碳含量高的样品；并且，采用TEN2+TX-100高盐预洗涤后再用裂解条件相对 温和的低盐提取法(如M2法)可得到较好的提取结果