食品中三种致病多重pcr检测体系的建立及初步应用.pdfVIP

摘要 近年来，全球食品安全恶性事件频发，食品安全问题是影响公共健康的重要因 素，已经成为社会关注的热点。其中，细菌性食物中毒是导致各种食品安全恶性事 件的主要原因。因此，食源性致病微生物的检测是食品卫生安全检测中一个重要的 部分。目前，食源性致病微生物主要采用分离、培养然后生化鉴定的方法，操作繁 琐，检测时间较长，通常需要3．5d才能完成，且每次只能检出一种致病菌，灵敏 度较低。因此，建立快速、高效、准确的食源性致病菌检测方法迫在眉睫。近年来， PCR技术发展十分迅速。多重PCR技术可以实现在一个反应管中同时对多种致病 微生物的检测，具有高效、低成本、高灵敏度等优点。因此，本研究建立了食品中 金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的多重PCR检测技术。 本文根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(nut)、沙门氏菌的侵染上皮细胞表 行多重PCR反应，可实现对三种致病菌的同时检测。试验过程中对反应体系中退 火温度、M92+、dNTPMixture、Taq酶和反应循环数等影响因素进行优化，确定了 最适多重PCR反应体系和循环参数。该反应体系为：2．510×PCRbuffer，2．0 gL gL dNTP MgS04，2．0gL Mixture，上游引物各1止，下游引物各1gL，O．5 gLTaq酶(5 940c预变性5min；940C变性40S，590c退火40S，720C延伸40S，30个循环；720C 终延伸10min。 在此条件下，检测了22株菌，4株金黄色葡萄球菌、4株沙门氏菌和4株蜡样 芽胞杆菌均为阳性结果，而其它10株菌均为阴性结果。将三种致病菌随机组合， 均能被检出。将多重PCR扩增产物胶回收进行核苷酸测序，将测序结果网上 BLAST，证实扩增产物与已知序列的同源性均达到99％，因而该多重PCR反应特 异性强。 本研究用该方法直接检测纯菌液，普通热裂解法提取DNA模板，金黄色葡萄 球菌的灵敏度为103CFU／mL，沙门氏菌的灵敏度为104CFU／mL，蜡样芽胞杆菌的 CFU／mL。 灵敏度为103CFU／mL；同时检出三种致病菌的灵敏度达到104 本研究采用五种不同方法从样品中提取三种致病菌DNA模板进行多重PCR反 应，比较DNA模板提取方法的优劣。结果显示，采用溶剂提取热裂解法提取DNA 模板效果好，操作较简便，且价格较低廉。该多重PCR反应检测人工污染纯牛奶， 采用溶剂提取热裂解法提取DNA模板，金黄色葡萄球菌检出限为102CFU／mL，沙 门氏菌检出限为104CFU／mL，蜡样芽胞杆菌检出限为102CFU／mL，同时检出三种 致病菌的检出限达到104CFU／mL。 对市场上购买的50份样品进行检测，并与国标方法对比，多重PCR方法检测 样品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样芽胞杆菌的敏感性均为100％；特异性： 金黄色葡萄球菌93．5％、沙门氏菌94．7％、蜡样芽胞杆菌90．6％；符合率分别为96％、 92％、94％。 本研究成功建立了多重PCR法检测食品中金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和蜡样 芽胞杆菌的反应体系。该方法具有特异性强、灵敏度高、检出限低、检测速度快和 操作简便等优点。该法初步应用于实际样品的检测，整个过程在6h以内即可完成。 因此，该多重PCR检测方法具有一定的实际推广价值，对及时检出食源性致病菌， 减少食源性致病菌引起的食物中毒，保障我国国民饮食安全具有重要的意义。 关键词：多重PCR；检测；金黄色葡萄球菌；沙门氏菌；蜡样芽胞杆菌 Establishmentand of PCRforDetectionofThree ApplicationMultiplex Food·borneBacterial Pathogens Name：2laangZheng