最新制生物化学与分子生物学基因结构分析的基本策略.ppt

1）羟自由基足迹法 （Hydroxyl radical footprinting） 化学试剂 羟自由基 利用化学试剂产生的羟自由基攻击DNA分子表面脱氧核糖骨架使DNA断裂 当DNA结合蛋白将脱氧核糖遮盖时，自由羟基无法攻击而使这个区域的DNA受到保护 电泳图谱上出现空白区的地方就是结合蛋白质的DNA 变性凝胶电泳 2）体内基足迹法 （In vivo footprinting） 用化学试剂对活细胞进行体内处理，使DNA在细胞内受到化学修饰，然后裂解细胞，用化学法或酶法进行足迹实验。 甲基化干扰实验 (Methylation interference assay) 是利用化学试剂如硫酸二甲酯（Dimethyl sulfate, DMS）对活细胞DNA进行甲基化修饰，从而干扰蛋白质与DNA的结合。 乙基化干扰实验 (Ethylation interference assay) 是利用化学试剂对活细胞DNA进行乙基化修饰，从而干扰蛋白质与DNA的结合。 化学试剂 提取DNA DNase I 或化学试剂 变性凝胶电泳分析 切割DNA 化学修饰对蛋白质与DNA的结合有干扰，因此，体内足迹实验也叫干扰实验 电泳图谱需与未修饰的DNA样品进行比较，在未修饰样品中出现空白区的位置是体内发生化学修饰的DNA区域 正常对照 化学修饰 提取DNA 2. 用电泳迁移率变动实验研究启动子 电泳迁移率变动实验 (Electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 是利用结合蛋白质的DNA片段在凝胶中迁移滞后的特点，通过电泳分离研究核酸-蛋白质互作的方法 又称为凝胶阻滞实验(Gel retardation assay) 细胞蛋白质提取物 标记的DNA片段 蛋白质与DNA结合 蛋白质-DNA复合物电泳迁移滞后 凝胶电泳 显影 滞后条带表明DNA是与蛋白质结合的区域 3.用染色体免疫沉淀技术研究启动子 染色体免疫沉淀 (Chromatin immunoprecipitation, ChIP) 是在保持蛋白质与染色体DNA结合的同时，将染色体切割成小片段并沉淀下来 非变性ChIP：是先用核酸酶处理细胞核，将染色体消化成碎片，然后用合适的抗体将结合有蛋白质的染色体片段通过免疫沉淀选择出来，再以PCR或核酸杂交技术对DNA序列进行分析 变性ChIP：是先用甲醛处理细胞，使蛋白质与DNA在细胞内发生交联，然后分离染色体并进行剪切，用特异性抗体与DNA结合蛋白相结合，以沉淀法分离DNA-蛋白质复合体 前面章节已介绍，这里不再详述 （三）生物信息学预测启动子 真核基因组的测序正在以不断增长的速度进行着，目前已经可以获得大约50个完整真核生物基因组的序列信息， 预计在未来几年内将会完成更多的基因组测序工作 对基因组注释工作中最难的就是精确鉴定和描绘启动子，因此，启动子的预测就显得非常重要 预测启动子的切入点 启动子的结构特征 启动子在染色体上的位置 1. 启动子的结构特征 典型启动子 核心启动子：一般在TSS上游-35区域以内 近端启动子：一般涉及TSS上游几百个碱基 远端启动子：一般涉及TSS上游几千个碱基 含有增强子或沉默子 一些特征性的结构 TSS附近的CG岛经常出现在启动子中 共通序列 (consensus sequence) 2. 启动子的预测分析 EPD (Eukaryotic promoter databases) TRRD (Transcription regulatory regions databases) 基因转录起始点数据库 (DBTSS) 启动子数据库 这些数据库主要通过计算机识别、判断及分析，在数据库中寻找启动子的特异性特征结构。 二、启动子的功能分析 启动子通常是基因上游参与基因转录调控的DNA序列。由于启动子中的顺式作用元件在基因的特异性表达中发挥重要作用，因此，可以通过连接报告基因研究启动子的功能。 1. 报告基因 (Reporter gene) 是研究者们为了制造一种可在细胞培养条件下或动植物体内作为筛选标志的易检测信号，通过分子生物学操作将发光蛋白或酶的编码基因附加到一个感兴趣基因上或插入基因调控序列下游，从而监测感兴趣基因的表达或分析基因调控序列的活性 。 常用的报告基因 荧光蛋白编码基因： 绿色荧光蛋白 (GFP) 红色荧光蛋白 (dsRed) 蛋白酶： 荧光素酶 (luciferase) ?-半乳糖苷酶 在蓝色光源照射下发绿光 能催化荧光素 (luciferin)发生氧化反应发光 能使细菌在X-gal存在条件下变成蓝色 2. 报告基因的应用 监测基因的转染效率