最新第六章真核基因在大肠杆菌中的表达.ppt

pPLc2833表达载体 调节型强启动子：能够使克隆的真核基因在大肠杆菌寄主细胞中最有效的高水平表达 组成： 1. 一个调节型的强启动子； 2. 一个用作选择记号的氨苄青霉素抗性基因ampr； 3. 一个直接位于PL启动子下游的多克隆位点（MCS）区 若由pKN402质粒的DNA复制起点取代pPLc2833质粒的DNA复制起点，由此形成的新质粒pCP3。它在大肠杆菌寄主细胞中指导外源蛋白质合成的有效性可得到有效的提高。而且这种质粒是温度敏感型的载体。（42度，拷贝数提高5～10倍） go 克隆的真核基因在 大肠杆菌细胞中的表达 外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 融合蛋白质的表达 1. 细胞质中表达 2. 周质中表达 3. 胞外表达 1.外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位 细胞质中表达: 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时，常会发生一种特殊的生理现象，形成包涵体（Inclusion Bodies，IB） 包涵体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基酸残基组分 优点： 1. 形成包涵体 a. 蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 b. 蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 c. 蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞受伤害 2. 蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用的丧失，会导致外源片断编码的蛋白质在大肠杆菌中超量表达。 3. 表达的质粒载体构建比较简单。 缺点： 1. 包涵体 a. 蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法恢复其生物学活性 b. 蛋白质的终产量偏低 c. 蛋白质的生产成本比较昂贵 2. 还原的环境不利于二硫键的形成 （硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统） 3. 由于N－末端存在甲硫氨酸。使蛋白质的真实性受影响 4. 蛋白质会被酶解 5.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂 周质中表达： 周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。 在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周质。 优点： 1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标蛋白质的纯化就比较简单 2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用（氧化环境） 在正确折叠的蛋白质，在转运过程中，在体内对信号肽进行切割 相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。当这些真核基因在大肠杆菌中表达时，蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起，一旦分泌型表达，其N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去 4. 蛋白质N-末端的结构真实 报告基因（reporter gene）： 特指那些编码产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元（半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰转移酶基因等）。 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织；也可用来同任何一种目的启动子连接，因此其表达活性可作为检测启动子功能的依据 利用CAT基因 进行功能启动子 的分离和活性测定 2.无启动子的CAT质粒载体 Ecoli DNA 构建Ecoli基因文库 细胞裂解物、 14C标记得氯霉素 乙酰辅酶A 薄层层析 放射自显影 CAT活性的检测： 氯霉素乙酰转移酶 可以催化氯霉素（2-或3-） 发生乙酰化作用。 3.使用tetr作报告基因分离功能启动子 1. 首先在大肠杆菌质粒pBR316（含有一个tet基因、Hind? 位点）上的tet的启动子序列中插入一个EcoR1的酶切位点（ pBRH3B, pBRH1 ），使之失活。 2. 将纯化的细菌染色体DNA片断，克隆在pBRH3B或 pBRH1 的EcoR1限制性位点上；转化给对tet敏感的大肠杆菌寄主细胞。 4.使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因分离功能启动子 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体系统。 来源于pBR322 转译终止密码子 无启动子的galK 原理： 半乳糖激酶能够从ATP分子上转移一个磷酸集团给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸化作用，形成半乳糖-1-磷酸。 用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因（galK）表达的半乳糖激酶的产量。 分离功能的启动子： 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1