FABP4转基因牛的分子生物学鉴定.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(24):4895-4903 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.24.013 FABP4转基因牛的分子生物学鉴定 1 1 3 2 1 1 1 1 1 1 赵敬贤 ，李 娟 ，严兴荣 ，倪和民 ，陈 燕 ，张路培 ，高会江 ，许尚忠 ，李俊雅 ，高 雪 1 2 3 （中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193 ； 北京农学院动物科学技术学院，北京 102206 ； 西北大学，西安 710068 ） 摘要：【目的】对前期获得的 3 头转基因牛进行分子生物学评价，包括转基因阳性鉴定、基因及蛋白表达水 平的检测，旨在进一步为转基因牛的安全评价提供一些科学依据。【方法】根据 GenBank 上公布的牛 FABP4 基因 （GenBank登录号：NM_174314）mRNA序列，利用兼并密码子对现有FABP4 基因进行突变，并构建了pEGFP-C1-FABP4 真核表达载体、通过细胞转染、体细胞核移植、胚胎移植技术获得 3 头转基因牛；分别采集了 1 号转基因牛不同 组织样，2、3 号转基因牛与野生型个体 8、10、12、14 月龄的血液样本，利用 RT-PCR 技术对所获转基因个体的 阳性与否进行了鉴定；同时利用荧光定量PCR技术检测了1 号转基因牛不同组织中外源性FABP4基因的表达情况， 并分析了2、3 号转基因牛在8—14月龄之间，外源性FABP4基因、内源性FABP4基因的变化趋势，并通过叠加转 基因牛外源与内源性 FABP4 基因的表达量，分析了转基因牛和非转基因牛 FABP4 基因的整体表达水平差异；通过 Western blotting 技术分析了 3 头转基因牛外源性 FABP4 基因的蛋白表达水平。【结果】①对所获得的 3 头转基 因牛RT-PCR检测发现，3头转基因个体各样本均在205 bp 处产生条带，而妊娠母牛及阴性对照在205 bp处均未 有条带出现，初步表明 3 头转基因牛均为转基因阳性。②实时定量 PCR 检测表明，1 号转基因牛的外源性 FABP4 基因在多数组织均有较高表达，其中脂肪组织表达量最高、肾脏和背最长肌次之，肺部的相对表达量极低。3 号 转基因牛外源性FABP4基因的表达水平高于2号转基因牛，且2、3号转基因牛外源性FABP4基因的表达水平随月 龄变化均呈现先上升后下降趋势；在内源性 FABP4 基因表达水平检测中发现，外源性 FABP4 基因的转入抑制了 转基因牛体内内源性 FABP4 基因的表达，且随月龄变化转基因牛体内内源性 FABP4 基因表达水平均呈现上升趋 势；野生型牛内源性 FABP4 基因的表达水平随着月龄变化逐步下降，而转基因牛体内内源性 FABP4 基因的表达 量均低于野生型牛；通过对 2、3 号转基因牛外源与内源性 FABP4 基因相对表达量的叠加分析发现，转基因牛 FABP4 基因整体表达量较野生型大幅升高。③蛋白表达检测结果与 mRNA 检测结果基本一致，外源性 FABP4 基因 在 1 号转基因牛除肺部外的各个组织均检测到外源 FABP4 基因的蛋白表达，其中背最长肌表达量最高；3 号转 基因牛蛋白表达水平高于 2 号转基因牛。【结论】获得的 3 头牛均为 FABP4 阳性转基因牛，且外源性 FABP4 基因 在体内能够正常表达，转基因牛 FABP4 表达量较野生型大幅升高，同时外源性 FABP4 基因的转入抑制了内源性 FABP4 基因的表达。 关键词：牛；转基因；FABP4基因；肌内脂肪；生物学鉴定 The Biological Identification of FABP4 Transgenic Cattle 1