H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(15):3064-3070 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.15.017 H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立 亓文宝，李 芳，李华楠，黄丽红，和 君，穆光慧，罗开健，廖 明 （华南农业大学兽医学院/人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室，广州 510642 ） 摘要：【目的】H9 亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病，该亚型病毒为 H7N9 亚型和 H10N8 亚型流感病毒 提供了 6 个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS），并且一直处于动态重组过程中。因此，建立针对 H9 亚型禽 流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法，加强 H9 亚型流感的监测，具有重要意义。【方法】用 钌联吡啶标记 H9 亚型 AIV 的单克隆抗体，用 MPI-E 型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率；用生物素 标记 H9 亚型 AIV 的多克隆抗体，HABA 法检测抗体生物素化的效率；待测抗原与钌标单抗作用 1 h 后，将此抗 原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应，最后加入反应底物三丙胺 后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度，确定临界值和反应谱， 对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后 3 d 和 5 d，采集攻毒组和空白对照组鸡只的 88 份 咽拭子和肛拭子，分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗 H9 亚型 AIV 单克隆抗体的标记效率为每个单抗 IgG 分子上结合 21 个 Ru2+ ，且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性； 生物素化兔抗 H9N2 亚型 AIV 多克隆抗体的标记效率为每个 IgG 分子上结合了 6 个生物素分子，且 Western blotting 试验证明其仍保持生物活性；该方法的检测临界值为 28.3，可疑区间为 23.4—33.2；阴性和阳性变 异系数均小于 10%；检测限为 5×104EID ，能够特异性地检测 H9 亚型 AIV，不与其他亚型流感病毒（H1、H3、 50 H4、H5 和 H6 亚型）和其他类型的禽源病毒（NDV、IBV 和 IBDV）反应。3 h 内即可完成检测，与鸡胚病毒分离 法的符合率为 86.4%。【结论】所建立的 H9 亚型 AIV 型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测， 对 H9 亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。 关键词：H9亚型禽流感；电化学发光免疫方法；快速检测 Electrochemical Luminescence Immunoassay for the Detection of H9 Subtype Avian Influenza Virus QI Wen-bao, LI Fang, LI Hua-nan, HUANG Li-hong, HE Jun, MU Guang-hui, LUO Kai-jian, LIAO Ming （College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University/National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonoses Prevention and Control, Guangzhou 510642) Abstract: 【Objective 】 H9 subtype avian influenza is an important zoonosis. Their six internal genes (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) of H7N9 and H10N8 subt