HOPX基因过表达对鸡前脂肪细胞增殖的影响.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(8):1624-1631 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.08.17 HOPX基因过表达对鸡前脂肪细胞增殖的影响 史洪岩，贺 綦，程 敏，孙婴宁，李 辉，王 宁 （东北农业大学动物科学技术学院/农业部鸡遗传育种重点实验室/黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室，哈尔滨 150030 ） 摘要： 【目的】构建鸡HOPX 基因（homeodomain only protein X）全长编码区（coding region sequence, CDS）的真核表达载体，转染鸡原代前脂肪细胞，探讨HOPX基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响。【方法】 利用 Primer Premier 5.0 软件设计鸡 HOPX 基因 CDS 区上、下游引物，以 AA 肉鸡腹部脂肪组织的 cDNA 为模板， 采用 PCR 扩增、克隆鸡 HOPX 基因全长 CDS 区，并将其亚克隆至真核表达载体（pCMV-HA vector），获得 HOPX 基 因的真核表达载体 pCMV-HA-HOPX。采用双酶切鉴定、测序及 Western blotting 方法分析鉴定 pCMV-HA-HOPX。采 用胶原酶法分离培养12日龄 AA商品肉仔鸡腹部脂肪组织原代前脂肪细胞，瞬时转染pCMV-HA-HOPX，转染6 h 时 后消化细胞，按照每孔50 000个细胞数接种12孔培养板，并在细胞贴壁0、24、48 和72 h，分别采用显微镜观 察和 CCK-8 细胞增殖检测试剂盒分析 HOPX 基因过表达对鸡原代前脂肪细胞增殖的影响；同时，利用 TRIzol 法提 取组织和细胞总RNA，并反转录合成cDNA，采用Real-time RT-PCR方法分析细胞增殖标志基因 Cyclin D1 和 PCNA 的mRNA表达。【结果】测序结果显示，鸡HOPX基因的全长CDS区大小为222 bp，与NCBI发布的鸡HOPX 基因mRNA 序列（NM_204556）一致；利用 HA 标签抗体的 Western blotting 分析显示，真核表达载体 pCMV-HA-HOPX 能够表 达出预期大小的蛋白分子（约 9.5kD），表明鸡 HOPX 基因的真核表达载体 pCMV-HA-HOPX 构建成功。显微镜观察 发现，转染pCMV-HA-HOPX载体的细胞（ HOPX 过表达组）在细胞贴壁后培养24和48 h的细胞数量低于转染pCMV-HA vector空载体（空载体对照组）的细胞数量；CCK-8检测分析发现，转染pCMV-HA-HOPX载体细胞的吸光度值（OD 值）在细胞贴壁后培养24、48和72 h都极显著低于空载体对照组（P ＜0.01）。与细胞增殖检测结果相一致，细 胞增殖标志基因表达检测分析发现，在细胞贴壁后培养24 h后，HOPX 过表达组细胞Cyclin D1基因的mRNA表达 量显著低于空载体对照组（P ＜0.05）；在细胞贴壁后培养48 h时，HOPX 过表达组的 PCNA 基因的mRNA表达量显 著低于空载体对照组（P ＜0.05）；在细胞贴壁后培养 72 h 时，HOPX 过表达组的 PCNA 和 Cyclin D1 基因的表达 量均极显著低于空载体对照组（P ＜0.01）。【结论】HOPX基因过表达在体外抑制鸡原代前脂肪细胞的增殖。 关键词：鸡；HOPX；前脂肪细胞；增殖 Effect of HOPX Gene Overexpression on Chicken Preadipocyte Proliferation SHI Hong-yan, HE Qi, CHENG Min, SUN Ying-ning, LI Hui, WANG Ning (College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University/Key