Pen a1抗原表位187mdash;202关键氨基酸的筛选和鉴定.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(9): 1793-1801 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.09.014 Pen a1 抗原表位187—202 关键氨基酸的筛选和鉴定 1 1 2 3 1 1 1 1 牟 慧 ，高美须 ，潘家荣 ，支玉香 ，赵 杰 ，刘超超 ，李树锦 ，赵 鑫 1 2 （农业部农产品加工重点实验室/ 中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193； 中国计量学院生命科学院，杭州 3100 18； 3 北京协和医院变态反应科，北京 100052） 摘要：【目的】Pen a1 是虾中主要的过敏原蛋白，其抗原表位与致敏作用有关。对 Pen a1 的一个抗原表位 187—202 中氨基酸的出现频率及保守性进行分析后合成突变肽，并检测该突变肽与表位抗体的结合能力，筛选关 键氨基酸，为研究虾致敏机理及脱敏方法提供理论依据。【方法】利用MEGA5 软件对Pen a1 蛋白5 个表位及其氨 基酸的组成与出现频率进行分析，选出这些表位中出现频率大的氨基酸；对过敏原数据库中所有致敏食物原肌球 蛋白的氨基酸序列的保守性进行分析，筛选出保守性高的氨基酸。两种方法筛选出的共有氨基酸为潜在的关键氨 基酸。用丙氨酸分别替代这些潜在的氨基酸形成突变肽。利用固相合成法分别合成原表位肽及突变肽。并将原表 位肽作为免疫原免疫新西兰大白兔，获得表位多克隆抗体。利用间接ELISA 方法及竞争性Dot-blot 方法检测突变 的表位肽与表位抗体IgE 结合能力，筛选出结合能力明显下降的突变肽，其中替换的氨基酸即为该表位的关键氨 基酸。【结果】谷氨酸（E ）、亮氨酸（L ）、精氨酸（R ）、谷氨酰胺（Q ）、缬氨酸（V ）、丝氨酸（S ）、天冬氨酸（D ） 在表位中出现频率较大，并高于在Pen a1 整体蛋白中出现的概率，为活性氨基酸。将序列在 187—202 的表位中 氨基酸组成及出现频率进行统计，推测E、V、L 可能为该表位的关键氨基酸。将SDAP 数据库中致敏食物原肌球蛋白 序列与 Pen a1 氨基酸序列用DNAMAN 软件进行多序列比对，K、L、E、V、G 在所有比对的序列中都存在，表明这 5 个氨基酸为保守氨基酸。选择共有的E、V、L 为可能的关键氨基酸，用丙氨酸替代表位中E、V、L 分别合成1、2 和 3 号突变肽。用竞争性Dot-blot 检测突变肽结合抗体能力，以提取纯化的虾致敏蛋白为包被原，用突变肽抑制虾蛋 白结合抗体，发现原表位肽抑制作用明显，1 号突变肽的抑制作用与原表位肽相似，2、3 号肽的抑制作用明显低于 原表位肽。谷氨酸突变的1 号突变肽对表位活性并没有较大影响，说明谷氨酸不是该表位的关键氨基酸；而2、3 号 突变肽与抗体的结合能力明显降低，即亮氨酸和缬氨酸是该表位的关键氨基酸。同时，利用间接ELISA 方法，将原 表位肽和突变肽与兔血清反应，比较OD 值。结果显示，1 号突变肽致敏性降低，OD 值约为对照的1/2.1，2 号突 450 450 变肽OD 值降低为对照的1/2.6，3 号突变肽OD 值降低为对照的1/3.2。说明突变表位与表位抗体结合能力均有不 450 450 同程度的降低。结合竞争Dot-blot 试验结果，亮氨酸和缬氨酸为该抗原表位的关键氨基酸。【结论】建立了一种关 键氨基酸的筛选和鉴定的方法。亮氨酸和缬氨酸被丙氨酸取代后，其与表位对应抗体的结合能力发生明显下降，是 Pen a1 中表位187—202 的关键氨基酸。这种筛选关键